WB内参选择指南

1、什么是内参？

内参是Western Blot实验中用于标准化和校正实验误差的一类蛋白质。它们通常是在不同组织和细胞中表达相对恒定的蛋白质，由管家基因编码，常用作检测目的蛋白表达水平变化时的参照物。

2、内参在WB中的作用是什么？

校正实验误差：内参用于校正蛋白质定量和上样过程中的实验误差，以保证实验结果的准确性。由于不同的样品在蛋白质提取、定量、上样等步骤中可能存在操作误差，使用内参可以对这些误差进行校正。

半定量分析：通过比较内参和目标蛋白的信号强度，可以对实验结果进行半定量分析。如果样品蛋白量有限，只够进行一次电泳转膜实验时，分别检测样品的内参量和目的蛋白量，然后将各样品目的蛋白量分别除以其内参含量，得到内参校正后的各样品中目的蛋白相对含量，用此数值进行样品间的比较和分析。

作为空白对照：内参可以作为空白对照，检测蛋白转膜情况是否完全，以及整个Western Blot显色或者发光体系是否正常。

确保实验结果的可比性：在比较不同条件下或不同组织中目的蛋白表达量的相对多少时，内参提供了一个参照标准，确保了实验结果的可比性。

3、常见的WB内参有哪些？

β-Actin：β-肌动蛋白是一种细胞骨架蛋白，分子量42KDa左右，广泛分布于各种组织中，表达量丰富且相对恒定。它通常用作总蛋白的内参，尤其是在非肌肉组织中。然而，需要注意的是，β-Actin在某些特定组织（如心肌）中的表达量可能较低，因此并非在所有情况下都适用。此外，不同的β-Actin亚型在不同组织中的分布也有所不同，选择抗体时需考虑这一点。

 大鼠脑裂解物20μg

 
                人结肠癌组织       

 Hela细胞 

GAPDH（甘油醛-3-磷酸脱氢酶）：36kD左右，GAPDH是一种广泛表达的蛋白，适用于多种细胞类型。然而，在某些条件下，如缺氧或糖尿病，GAPDH的表达可能会受到影响，因此需要根据实验条件谨慎选择。

 1: HeLa whole cell lysate 20 ug Lane 
2: THP-1 whole cell lysate 20 ug Lane
 3: MCF7 whole cell lysate 20 ug Lane 
4: NIH/3T3 whole cell lysate 20 ug Lane 
5: mouse spleen lysate 20 ug Lane
 6: C6 whole cell lysate 20 ug Lane 
7: rat spleen lysate 20 ug 
 

β-Tubulin：55kDa左右，β-Tubulin是微管蛋白的一种，参与构成细胞骨架。由于其在细胞中的稳定表达，尤其用于检测细胞骨架蛋白时。β-Tubulin的表达在多种细胞类型中相对恒定，但同样需要考虑特定条件下的表达变化，如在 凋亡细胞中。

 Hela细胞全裂解物

        大鼠肾组织        

 NIH3T3 细胞

除了以上介绍的内参以外，还有α-Tubulin、Hsp90等等，每个内参的分子量及适用情况不一样，建议选择之前做好功课。

4、如何挑选合适的内参，需要考虑哪些因素？

目的蛋白分子量：内参蛋白的分子量应与目标蛋白的分子量相差至少5kDa以上，以确保在凝胶电泳和Western Blot中能够清晰地区分目标蛋白和内参的条带。

样本种属来源：不同种属的样本可能需要选择不同的内参蛋白。例如，哺乳动物的组织或细胞样本常选择β-actin、β-tubulin、GAPDH等，而植物样本可能选择plant actin、Rubisco等作为内参。

细胞定位：根据目标蛋白的亚细胞定位选择相应的内参。例如，如果是检测全细胞或细胞质蛋白，可以选择β-actin、β-tubulin、GAPDH等；如果是核蛋白，则可能选择Lamin B、Histone H3等作为内参。

实验环境：内参的选择还需要考虑实际的实验环境和样品的前处理。在某些特殊条件下，一些内参蛋白的表达可能会发生变化，从而影响其作为内参的稳定性和可靠性。例如，在缺氧或糖尿病等条件下，GAPDH的表达可能会增加，因此可能不适合作为内参。

组织特异性：不同的组织可能需要选择不同的内参。例如，肌肉组织中可能需要选择特定的肌动蛋白亚型作为内参，而在非肌肉组织中则可能选择β-actin等。

5、内参抗体和目标抗体如何孵育？

顺序孵育：在检测完目标蛋白后，使用strip缓冲液洗掉膜上的抗体，然后重新进行内参蛋白的抗体温育和显色检测。这种方法需要在两次孵育过程中使用同一张膜。

双膜法：在蛋白转膜后，根据预染的蛋白质Marker的大小将膜剪成大分子量和小分子量两部分，使内参蛋白与目的蛋白分开。然后两块膜分别与内参蛋白抗体以及目的蛋白抗体进行孵育和显色。

同时孵育（如果分子量相差较大）：如果目的蛋白的分子量与内参蛋白的分子量相差较大，可以在转膜后的同一张膜上同时进行两种抗体的孵育。由于条带位置的差异，可以在同一张膜上分别检测内参和目标蛋白。

使用标记内参抗体：有些实验室使用预先标记有酶（如HRP）的内参抗体，这样可以在二抗孵育时加入这种标记内参抗体，按照正常操作进行显色。

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