2026V3 | 渐进性峰形畸变机制解析：硫酸艾沙康唑杂质HPLC溶剂影响研究

高效液相色谱法(HPLC)是药品质量控制中应用非常广泛的一种仪器分析手段，可用于化合物的定性和定量分析，但由于溶解样品所用的溶剂与流经色谱系统的流动相经常不一致，有时会产生溶剂效应，引起峰形畸变、保留漂移、分离变差等现象，严重影响HPLC定性和定量分析的准确性。

我司在用HPLC检测硫酸艾沙康唑杂质RM-I192220 (Isavuconazole Impurity 20/BAL19714; CAS No: 2733698-17-2)时观察到由溶剂引起的峰形畸变现象，因此进一步研究了溶剂与峰形畸变之间的渐进关系，积累数据以供参考，便于在HPLC检测中出现类似情况时对比分析原因并纠正，避免误判结果。

一、研发背景：红外数据异常

2021年12月，硫酸艾沙康唑胶囊获得国家药品监督管理局批准上市，批准适应症为：用于治疗成人侵袭性曲霉病和毛霉菌病，成为我国首个获批用于治疗成人侵袭性毛霉病的口服抗真菌药。

目前各国药典均未收录该药品的质量标准，国内仅有进口药品注册标准，RM-I192220为硫酸艾沙康唑胶囊、注射液注册标准中均有控制的杂质BAL19714，其标准相对保留时间(RRT)为0.36，出峰较早，相对更容易受溶剂效应影响，在检测中我们观察到该杂质峰的色谱行为，与溶剂中有机相的比例存在一定关系。因此我们进行了相关实验研究，其主要内容为用不同比例的乙腈溶解杂质BAL19714后，考察溶剂中乙腈比例、进样量与峰形的关系。

图1:杂质BAL19714结构

二、结果讨论

1、实验设计

仪器：Thermo U3000高效液相色谱仪

色谱条件：硫酸艾沙康唑制剂注册标准的有关物质方法

样品溶液：

• 样品溶液1（8mg/ml，溶剂15%乙腈）

  
  

• 样品溶液2（1mg/ml，溶剂15%乙腈）

  
  

• 样品溶液3（1mg/ml，溶剂25%乙腈）

  
  

• 样品溶液4（1mg/ml，溶剂50%乙腈）

实验方案

分别考察单因素变量：

(1)溶剂中乙腈比例 （2)杂质溶液浓度 （3)进样体积对色谱峰形的影响。

2、图谱数据

（1）单因素变量-溶剂中乙腈比例

图2:单因素变量-溶剂中乙腈比例-对比图

· 

Ø 数据分析：分别用15%、25%、50%的乙腈作为溶剂，配置相同浓度的杂质溶液、各进样50μl。发现以15%的乙腈作为溶剂不易引起峰形畸变，为其中最优选的溶剂。

· 

（2）单因素变量-杂质溶液浓度

图3:单因素变量-杂质溶液浓度-对比图

Ø 数据分析：以15%乙腈作为溶剂，分别配制1mg/ml、8mg/ml的杂质溶液，各进样20μl。1mg/ml的杂质溶液主峰峰高约为300m AU，0.05%（该注册标准忽略限）倍主峰峰高仅为0.15m AU，考虑到仪器灵敏度，8mg/ml为其中更优选的纯度检测溶液浓度.

（3）单因素变量-进样体积

图4：单因素变量-进样体积（溶剂15%乙腈）-对比图

Ø 数据分析：以15%乙腈作为溶剂，配制1mg/ml的杂质溶液，分别进样20、50、70、100μl。当进样量达到70μl时，峰形开始发生畸变。

图5：单因素变量-进样体积（溶剂25%乙腈）-对比图

Ø 数据分析：以25%乙腈作为溶剂，配制1mg/ml的杂质溶液，分别进样20、50、70、100μl。当进样量达到50μl时，峰形开始发生畸变。

图6：单因素变量-进样体积（溶剂50%乙腈）-对比图

Ø 数据分析：以50%乙腈作为溶剂，配制1mg/ml的杂质溶液，分别进样10、20、30、50。当进样量达到20μl时，峰形开始发生畸变。

图7：溶剂中乙腈量与峰畸变关系-对比图

综上，当注入色谱系统的样品溶液中乙腈量达到10μl，主峰前检出的杂质小峰开始展宽，并随乙腈量增加逐渐裂分；当乙腈量达到15μl，主峰开始畸变；当乙腈量达到20μl，主峰因被大幅度提前洗脱而裂分为多个峰，如图7。因此，溶剂中乙腈比例建议不高于25%，此时20μl为最优选的进样体积。

3、结论

该注册标准有关物质检测方法的梯度程序初始有机相比例为2.5%，样品溶剂中乙腈的比例为15%，进样量为20μl，由本次试验考察结果来看，该方法的参数设置合理。

该方法的梯度初始有机相比例仅为2.5%，在这样一个有机相比例较低的流动相体系下，注入过多强洗脱能力的溶剂，会使样品中的组分被提前洗脱而引起色谱峰畸变，尤其是出峰较早的组分更容易受到影响。溶剂的洗脱能力越强，色谱峰畸变越明显，存在渐进的关系。

三、经验总结

注入样品溶液可以视为对色谱系统流动相的一次短暂性改变，尽管为了避免打破平衡状态，应尽可能选择与流动相洗脱能力接近的溶剂溶解样品。但综合考虑样品溶解性、溶液稳定性等原因，仍然不可避免使用较强洗脱能力的溶剂。

TIPS | 建议

1、尽量选择与流动相接近的溶剂，如直接使用流动相作为溶剂，或有机相比例与流动相接近、更低的溶剂，通常有机相比例更低的溶剂带来的负面影响较小。

2、如采用有机相比例更高的溶剂，可通过减少进样量来消除溶剂效应，但还需考虑进样后溶质是否会在流动相中析出，这时可能会出现滞后出峰而拖尾的情况。

3、如出现异常的色谱峰形，可以通过减少进样量、降低有机相比例来考察是否为溶剂效应影响。

4、可在色谱柱前加装溶剂效应消除器或增加管路，使进样的组分更充分扩散到流动相中，可以一定程度上消除溶剂效应。