乙酰基四肽-9的液相合成方法

概述

乙酰四肽-9又名乙酰基四肽-9，是一种由四个氨基酸残基（谷氨酸、天冬氨酸、缬氨酸、组氨酸）的多肽物质，常温下状态为白色粉末。该物质的N-端经乙酰化修饰，这种结构赋予其良好的稳定性和皮肤渗透能力。此外，该物质还可以通过激活真皮层成纤维细胞，增加胶原蛋白和弹性蛋白的分泌，提升皮肤紧实度，尤其对眼周等脆弱区域的松弛问题有针对性效果。

乙酰基四肽-9  化学结构式

基本信息

中文名称：乙酰基四肽-9

英文名称：Acetyl Tetrapeptide-9G

公司编号：GT-C046

CAS号：928006-50-2

序列：Ac-Gln-Asp-Val-His-OH

分子式：C22H33N7O9

分子量：539.54

制备方法

1、合成Ac-Gln(Trt)-Asp(OtBu)-OH

在500mL反应瓶中加入200mL 1mol/L NaOH水溶液38.8g(0 .1mol)H-Gln(Trt)-OH，搅拌至溶解后降温至0℃。在此温度下缓慢滴加14mL(0 .15mol)乙酸酐，在0～5℃下反应8小时，加入0 .5mol/L的盐酸水溶液调节至析出大量白色固体，保持0℃搅拌2小时，过滤，滤饼经50mL冰水洗涤、40℃真空干燥，得到40g白色固体Ac-Gln(Trt)-OH。

将40g(0 .093mol)Ac-Gln(Trt)-OH溶于盛有400mL四氢呋喃的1000mL反应瓶中，降温至0～5℃，依次加入16 .9g(0 .125mol)1-羟基苯并三唑、30 .9g(0 .15mol)N ,N′-二环己基碳二亚胺。在0～5℃下反应3小时，停止反应，过滤掉不溶物，将滤液转入1000mL反应瓶中，加入100mL含有20 .9g(0 .11mol)H-Asp(OtBu)-OH和42mL(0 .382mol)N-甲基吗啉的四氢呋喃溶液。在0～10℃下反应1小时后自然升温至室温反应12小时，停止反应，减压脱除四氢呋喃，加入200mL0 .5mol/L的盐酸水溶液，用乙酸乙酯萃取(300mL×3次)，有机相经饱和食盐水洗涤、无水硫酸钠干燥、减压浓缩、真空干燥，得到50g白色固体Ac-Gln(Trt)-Asp(OtBu)-OH。

乙酰基四肽-9 MS图

2、合成H-Val-His(Trt)-OH

在1000mL单口瓶中加入44 .8g(0 .132mol)Fmoc-Val-OH和500mL四氢呋喃，搅拌溶解后降温至0～5℃。加入18 .9g(0 .164mol)N-羟基丁二酰亚胺、40 .8g(0 .198mol)N ,N′-二环己基碳二亚胺，反应4小时，过滤除去不溶物。将滤液转入1000mL反应瓶中，加入27 .7g(0 .33mol)碳酸氢钠以及100mL纯水，降温至0～10℃，搅拌下加入63 .2g(0 .159mol)H-His(Trt)-OH，反应12小时，减压浓缩除去四氢呋喃，加入400mL乙酸乙酯和150mL0 .5mol/L的盐酸水溶液，萃取分液，饱和食盐水洗涤有机相。减压脱除溶剂后溶于300mL四氢呋喃中，加入50mL哌啶，室温搅拌反应2小时，减压脱除溶剂，加入氨水溶液200mL，析出白色固体，抽滤，滤饼用200mL甲基叔丁基醚打浆搅拌1小时，过滤，滤饼经甲基叔丁基醚洗涤、40℃真空干燥，得到55 .6g白色固体H-Val-His(Trt)-OH。

3、合成Ac-Gln-Asp-Val-His-OH

在1000mL反应瓶中加入50g(0 .083mol)Ac-Gln(Trt)-Asp(OtBu)-OH、500mL四氢呋喃，搅拌溶解后降温至-5～5℃。加入19 .2g(0 .124mol)1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺、22 .4g(0 .166mol)1-羟基苯并三唑，在-5～0℃下反应4小时，过滤除去不溶物，向滤液中加入53 .1g(0 .107mmol)H-Val-His(Trt)-OH、36mL(0 .332mol)N-甲基吗啉，反应6小时，减压浓缩脱除四氢呋喃，加入300mL乙酸乙酯、300mL水，萃取分液，有机相经饱和食盐水洗涤、无水硫酸钠干燥后减压脱除溶剂，得到76 .2g Ac-Gln(Trt)-Asp(OtBu)-Val-His(Trt)-OH。

乙酰基四肽-9  HPLC

将76.2g Ac-Gln(Trt)-Asp(OtBu)-Val-His(Trt)-OH溶于200mL切割液(由180mL三氟乙酸、10mL三异丙基硅烷、10mL水混合而成)，室温搅拌2小时，过滤，滤液减压浓缩除去三氟乙酸至无液体溢出。采用反相高效液相色谱纯化(流动相A：体积分数为0 .05％的三氟乙酸水溶液；流动相B：体积分数为0.05％的三氟乙酸甲醇溶液，洗脱梯度：流动相B 3％5min、3％-15％ 60min、15％恒流；检测波长215nm，流速20mL/min，色谱柱规格：5cm×45cm，填料：GEL反相聚合物)。然后采用离子交换除去三氟乙酸(体积分数为2％的乙酸水溶液恒流，检测波长215nm，流速8mL/min，色谱柱规格：5cm×45cm，填料DEAE)。冷冻干燥，得到34g  Ac-Gln-Asp-Val-His-OH，即乙酰基四肽-9，收率63％，HPLC纯度98％。

结论

本方法采用液相合成法，由两个片段缩合而成，相比较逐个氨基酸缩合来延长肽链的方式，能有效的提高反应效率，采用乙酰基保护N端为起始原料，减少了最后N端的脱保护，整个过程无需复杂纯化，可得到纯品较高的全保护四肽，相较于传统的固相合成，避免了高毒性溶剂的大量使用，成本低廉，易于规模化放大，经济效益明显。

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