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发布人：上海西格生物科技有限公司
发布日期:2025/12/29 9:27:10
为何纯化后会出现异常？
PCR产物纯化是分子克隆、测序等下游实验的关键前置步骤。尽管试剂盒使用简便，但若忽略细节（如pH控制、乙醇残留、洗脱体积等），仍可能导致DNA得率低或质量差，进而影响后续实验结果。以下是对常见问题的系统性归纳与解决方案。
下表总结了PCR产物纯化中最典型的5类问题、可能原因及对应解决策略：
常见问题
可能原因
解决方法与建议
回收率低
结合液用量不足或比例错误
离心力不够或时间太短
洗脱液体积过小或pH偏低
严格按1:1比例加入结合液（每1μl DNA溶液加1μl MB）
确保离心≥12,000 rpm且充分通过膜
-洗脱液≥30 μl，pH调至7.0–8.5
电泳出现多条带/拖尾
切胶时紫外照射时间过长导致DNA损伤
回收产物含引物二聚体或其他小片段杂质
快速切胶，避免长时间暴露于UV下
若为直接纯化，优先选择可去除小片段的试剂盒；必要时重新切胶回收
OD260/230比值偏低
漂洗液中乙醇未完全去除
存在碳水化合物或酚类残留
漂洗后空柱离心2分钟，并开盖晾干2–5分钟
使用新鲜试剂，确保无污染
连接/转化效率低
洗涤不彻底，残留抑制剂（如盐离子、乙醇）
DNA末端受损
彻底去除漂洗液残留；必要时进行乙醇沉淀二次纯化
使用高活性感受态细胞，检查连接体系
测序信号弱或背景高
模板量不足或过高
含EDTA的TE缓冲液抑制测序酶活性
调整DNA用量至合适范围
避免使用含EDTA的TE缓冲液，改用无核酸酶水或EB缓冲液
补充说明：部分试剂盒虽能有效去除大部分引物和dNTP，但无法100%清除引物二聚体，尤其当其浓度较高时，仍可能干扰克隆构建。此外，若原始PCR产物含有非特异性条带，仅靠直接纯化无法分离目标片段，必须采用切胶回收法以保证纯度。
其他典型问题与应对
问题：纯化后电泳出现双带或多带？
可能是小片段产物更易受残留杂质影响，或存在不同构象的DNA形式。若不影响下游应用（如测序），可不必担忧。若用于克隆，则建议重新优化PCR条件并切胶回。
问题：石蜡油是否影响回收？
是的，PCR反应中若使用石蜡油覆盖，可能会降低回收率。建议在纯化前清除石蜡油，或增加结合液体积（如使用10倍体积PB液）以提高结合效率
问题：能否用水代替洗脱缓冲液？
可以，但需确保水的pH在7.0–8.5之间，否则会显著降低洗脱效率。推荐优先使用试剂盒配套的EB缓冲液。
建议：如何预防常见问题？
操作规范：全程使用一次性枪头与离心管，防止交叉污染；
环境洁净：定期清洁工作台面，必要时用紫外线照射破坏游离DNA；
试剂状态：确认漂洗液已添加乙醇，避免因挥发导致洗涤失败。
温度控制：对大片段DNA，可用预热至60–70°C的洗脱液提升回收率；
验证纯化效果：纯化前后均应进行琼脂糖凝胶电泳检测，确认目标条带存在且无杂带。
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