别让纯化拖后腿！PCR产物纯化效率提升小技巧

PCR扩增后，反应体系中常含有dNTP、引物、聚合酶、盐离子等杂质，这些成分会影响后续的克隆、测序或酶切实验。因此，必须对PCR产物进行纯化回收。根据产物纯度需求和条带情况，主要分为直接纯化和凝胶回收纯化两种途径。提升效率的核心在于减少DNA损失、提高回收率和保证纯度。

方法选择与效率对比

不同纯化方法适用于不同场景，其回收率、纯度和操作复杂度差异明显：

补充说明：当PCR产物较纯时，优先使用直接纯化以获得更高回收率；若存在非特异扩增，则必须通过凝胶回收确保纯度。

提升纯化效率的具体技巧

优化切胶操作：

使用长波长UV灯（如365 nm）观察并切胶，减少DNA损伤。

切胶动作要快，且只切下含目的条带的最小凝胶块，避免过多琼脂糖影响溶胶效率。

若目的片段 < 500 bp，可在溶胶后加入异丙醇促进DNA结合吸附膜

提高结合与洗脱效率：

溶胶必须彻底，可置于55–65°C水浴中加热5–10分钟，并间歇混匀。

溶胶液冷却至室温后再上柱，高温会降低DNA与硅胶膜的结合效率。

预热洗脱缓冲液（Elution Buffer）至60–70°C，能显著提升洗脱得率。

洗脱时让缓冲液在膜上静置1–2分钟再离心，有助于充分溶解DNA。

增强回收策略：

可尝试二次上柱：将第一次洗脱液重新上柱一次，进一步提高回收率。

空柱最后高速离心2分钟，去除残留乙醇，防止抑制下游反应。

使用高质量的吸附柱或磁珠试剂盒，劣质材料会导致结合能力下降。

特殊场景应对：

若PCR体系中含有石蜡油，应在纯化前清除，否则会显著降低回收率。

对于GC富集区扩增产物，可通过优化PCR条件先提高特异性，减少杂带产生。

扩增模板为质粒时，建议采用凝胶回收方式，避免残留质粒干扰。

建议

1、纯化前后均进行电泳检测：验证目标条带是否存在及评估回收效果。

2、根据DNA片段长度选择合适试剂盒，避免因片段过长或过短导致无法有效结合。

3、操作全程佩戴乳胶手套，避免皮肤酶或污染物降解DNA。