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发布人：上海西格生物科技有限公司
发布日期:2025/12/26 9:28:20
细胞株传代是维持细胞持续增殖和实验可重复性的基础操作。当细胞生长至80%-90%汇合度时，因接触抑制或营养耗尽将停止分裂，必须通过传代提供新的生长空间。此过程不仅用于扩增细胞数量，也是保持细胞处于对数生长期、确保实验数据可靠性的关键步骤。
操作流程与关键控制点
以下是贴壁细胞株传代的标准流程及各环节的注意事项：
步骤
操作要点
注意事项与风险提示
1.传代前准备
在超净台内准备好预热的PBS、胰酶（如0.25% Trypsin-EDTA）、完全培养基；显微镜下确认细胞汇合度达80%-90%，无污染迹象。
必须在倒置显微镜下检查细胞状态，避免在细胞密度过高或已有污染时传代。
2.清除旧液与洗涤
吸弃旧培养基，用无钙镁离子的PBS轻柔冲洗1-2次，彻底去除残留血清（含胰酶抑制剂）。
PBS不可直接冲击细胞层，应沿瓶壁加入，防止细胞脱落。
3.胰酶消化
加入适量胰酶（T25瓶约1-2mL），37℃孵育1-3分钟；必须在显微镜下实时观察，直至多数细胞变圆、间隙增大。
消化不足：细胞成团，影响后续生长；消化过度：损伤细胞膜，降低存活率。不同细胞敏感性差异大，需摸索最佳时间。
4.终止消化与吹打
加入含血清的完全培养基终止胰酶活性；用弯头吸管轻柔吹打瓶壁，使细胞完全脱落形成单细胞悬液。
吹打力度过大会产生气泡，造成机械损伤；未充分吹散会导致细胞聚团8。
5.计数与接种
使用血球计数板或自动计数仪标准化细胞密度，按推荐比例接种（如1:2至1:10）。
接种密度过低可能导致细胞老化，过高则迅速进入平台期。
6.培养与观察
将新培养瓶放入37℃、5% CO₂培养箱，次日观察贴壁情况。若漂浮细胞过多，应及时换液。
需记录传代日期、代数，避免过度传代导致遗传漂变。
关键细节说明
1、胰酶选择
含EDTA的胰酶能螯合钙镁离子，增强细胞解离效果，适用于贴附较牢的细胞（如上皮细胞）；不含EDTA的胰酶适用于较脆弱的细胞，以减少损伤。
2、消化时间动态调整
消化时间并非固定值，受细胞代次、密度、温度和胰酶活性影响。例如，在37℃下消化比室温快得多。建议每次均在显微镜下监控，以“细胞变圆、轻拍瓶壁可脱落”为终点。
3、无菌操作原则
全程在超净台内进行，手、瓶口等需酒精消毒，避免交叉污染。每种细胞使用独立试剂和耗材。
4、细胞代数管理
有限细胞株（如正常人源细胞）传代次数有限（约20-30次），端粒缩短会导致衰老；连续细胞株（如HeLa）虽可长期传代，但也会积累突变，影响实验一致性。
结论
成功传代的核心在于“精细操作+实时监控”：务必在显微镜下判断消化程度，避免一刀切的时间设定；采用轻柔吹打和标准化接种密度，可显著提升细胞活力与实验可重复性。同时，做好细胞系分类管理——有限株注意代次，连续株警惕遗传漂变。
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