硝基咪唑类药物快速检测试剂盒

硝基咪唑类药物快速检测试剂盒

使用说明书

【原理】

本试剂盒是利用竞争ELISA方法，在酶标板微孔上预包被抗 硝基咪唑类药物抗原。检测时，加入标准品或样品溶液，硝基咪唑类药物抗体及酶标记物，包被抗原和加入样本中的硝基咪唑类药物竞争性地与硝基咪唑类药物抗体结合后，再与酶标记物形成抗原抗体复合物，用TMB底物显色；加入反应终止液，在450nm波长酶标仪下进行检测，样品中的硝基咪唑类药物浓度与吸收光强度成反比。

【适用范围】

本试剂盒是应用ELISA技术研发的药物残留检测产品,与仪器分析技术比较，能经济、快速地检测出肌肉、肝脏等中的硝基咪唑类药物类药物。

【试剂盒技术指标】   

规      格：96孔/盒

灵 敏 度：0.1ppb

检测时间： 45min

样本检测下限：

蜂蜜…………………………………………0.3ppb

组织………………………………………… 0.3ppb

蛋类…………………………………………0.3ppb

样本回收率

蜂蜜……………………………………75% ±15%

组织……………………………………75% ±15%

蛋类……………………………………80% ±10%

交叉反应率

甲硝唑………………………………………………100%

替硝唑………………………………………………80%

地美硝唑……………………………………………72%

洛硝达唑……………………………………………45%

【试剂盒组成】   

1、 微量测试孔：（1X96孔板）每条8孔，一板12条

2、 标准液X6瓶：（1ml/瓶） 0ppb、0.1ppb、0.3ppb、0.9ppb、2.7ppb、8.1ppb

3、 高浓度标准品×1瓶：（1ml/瓶）100ppb

4、 酶标记物         7ml…………………………红色帽

5、 抗体工作液     7ml…………………………绿色帽

6、 底物液 A液    7ml…………………………棕色帽

7、 底物液 B液    7ml…………………………黑色帽

8、 终 止 液          7ml…………………………黄色帽

9、 20X浓缩洗涤液40ml…………………… 白色帽

10、 2X浓缩复溶液50 ml      ………………… 蓝色帽

【所用仪器、试剂】   

仪          器：微孔板酶标仪450nm/630nm、旋转蒸发仪/氮气吹干装置、均质器、振荡器、离心机、 刻度移液管、天平（感量0.01g ）

微量移液器：单道 20µl～200µl、100µl～1000µl、多道 250µl

试           剂：乙酸乙酯、NaOH、正己烷

【实验前溶液配制】

配液1、0.1M氢氧化钠溶液

          称0.4gNaOH加去离子水混匀溶解，定容至100ml

配液2、将2X浓缩复溶液用去离子水按照1：1稀释（1 份浓缩复

溶液+1份去离子水）用于样本的复溶。

配液3、将40ml浓缩洗涤液（20倍浓缩）用去离子水按照 1：19

稀释（1份浓缩洗涤液+19份去离水）; 或按所需用量配制

洗涤液

【样本前处理步骤】   

处理任何样本时，都必须注意：

（1）实验中必须使用一次性吸头，在吸取不同的试剂时要更换吸头。

（2）实验之前须检查实验器具是否干净，必要时可对实验器具进行清洁，以避免污染干扰实验结果。

（a ）动物组织、蜂蜜、蜂皇浆、样本

1、称2.0±0.05g 均质过的样本于50ml离心管中；

2、加入3ml 0.1M氢氧化钠溶液，充分混匀1分钟

3、加入6ml乙酸乙酯充分振荡5分钟，室温4000r/min，离心5分钟；

4、取3ml清澈上层有机相至干净玻璃试管中，56℃水浴氮气/空气吹干；

5、加0.5ml正已烷振荡30秒，再加入1ml稀释好的复溶工作液充分振荡混合30秒；室温4000转/分，离心5分钟；

6、去除上层有机相，取下层50µl用于分析

      样本稀释倍数：1

（a ）蛋类样本

1、称2.0±0.05g 均质过的样本于50ml离心管中；

2、加入6ml乙酸乙酯充分振荡5分钟，室温4000r/min，离心

5分钟；

3、取3ml清澈上层有机相至干净玻璃试管中，56℃水浴氮气/

空气吹干；

4、加0.5ml正已烷振荡30秒，再加入1ml稀释好的复溶工

  作液充分振荡混合30秒；室温4000转/分，离心5分钟；

去除上层有机相，取下层50µ用于分析

      样本稀释倍数：1

【酶标免疫分析程序】   

操作步骤：

1、 从4℃冷藏环境中取出所需试剂，置室 温（20-25℃）平衡30min以上，注意每种液体试剂使用前均须摇匀。

2、 取出框架及需要数量的微孔，将不用的微孔放入自封袋，保存于2-8℃。

3、 编号：将样本和标准品对应微孔按序编号，每个样本和标准品做2孔平行，并记录标准孔和样本孔所在的位置

4、 加标准品或样本50µl/孔到各自的微孔中，然后加入酶标记物50µl/孔后再加抗体50µl/孔，用盖板膜封板，轻轻振荡混匀。25℃环境中反应30min。

5、 取出将孔内液体甩干，用洗液250µl /孔，洗板4－5次，每次间隔15-30s，用吸水纸拍干（拍干后未被清除的气泡可用干净的枪头刺破）。

6、 显色：每孔加入底物液A液50µl， 再加B液50µl，轻轻振荡混匀，25℃环境中避光显色15min。

7、 测定：每孔加入终止液50µl，轻轻振荡混匀，设定酶标仪于450nm处（建议用双波长450/630nm检测，在5min内读完数据），测定每孔吸光度值（OD值）。

【结果判定】

结果判定有两种方法，粗略判定可用第1种方法，定量判定用第2种方法。注意样本吸光值与硝基咪唑类药物的含量成负相关。

1、粗略判定：

用样本的平均吸光度值与标准吸光度值比较即可得出其浓度范围(ppb)。假设样本1的吸光度值为0.310， 样本2的吸光度值为0.820，标准液吸光度值分别是：0ppb为1.610；0.1ppb为1.350；0.3ppb为1.030；0.9ppb为0.660；2.7ppb为0.379；8.1ppb为0.198。则样本1的浓度范围是2.7ppb-8.1ppb； 样本2的浓度范围是0.3ppb-0.9ppb。乘以其对应的稀释倍数即为样本中硝基咪唑类药物的实际含量。

2、定量判定：

所获得的每个浓度标准溶液和样本吸光度值的平均值（B）除以第一个标准（0标准）的吸光度值（B₀）再乘以100%，即百分吸光度值。

B—标准溶液或样本溶液的平均吸光度值

B₀—0ng/ml标准溶液的平均吸光度值

以标准品百分吸光率为纵坐标，以硝基咪唑类药物标准品浓度（ng/ml）的半对数为横坐标，绘制标准曲线图。将样本的百分吸光率代入标准曲线中，从标准曲线上读出样本所对应的浓度，乘以其对应的稀释倍数即为样本中硝基咪唑类药物实际浓度。

若利用试剂盒专业分析软件进行计算，更便于大量样品的准确、快速分析。

3、标准准曲线：

B/B0 (%)

                  0.1                 0.3               0.9                2.7               8.1                                                     硝基咪唑类药物(ppb) 

图1：硝基咪唑类药物检测试剂盒的回归曲线

4、再现性：

%CV

       0      0.1       0.3      0.9     2.7     8.1

硝基咪唑类药物(ppb) [µg/kg]

图2：硝基咪唑类药物检测试剂盒的精密度

  由多个不同的实验结果确定了精密度，图2显示出硝基咪唑类药物检测试剂盒的精密度情况，获得的标准吸收值的变异系数（%CV）对相应硝基咪唑类药物浓度作曲线，可以看到全部范围内变异系数如此之低，可以得到很好的再现性。

【注意事项】   

1、 使用前将所有试剂温度回升至室温20-25℃。试剂及标本没有回到室温（20-25℃）会导致所有标准的OD值偏低。

2、 在洗板过程中如果出现板孔干燥的情况，则会伴随着出现标准曲线不成线性，重复性不好的现象。所以洗板拍干后应立即进行下一步操作。

3、 混合要均匀，否则会出现重复性不好的现象。

4、 反应终止液为2M硫酸，避免接触皮肤。

5、 不要使用过了有效日期的试剂盒，稀释或搀杂使用会引起灵敏度、OD值的变化。不要交换使用不同批号的盒中试剂。

6、 不用的微孔板放进自封袋密封；标准物质和无色的发色剂对光敏感，因此要避免直接暴露在光线下。

7、 显色液若有任何颜色表明变质，应当弃之。0标准的吸光度值小于0.5个单位（A_450nm< 0.5 ）时，表示试剂可能变质。

8、 该试剂盒最佳反应温度为25℃，温度过高或过低将导致检测吸光度值和灵敏度发生变化。

【储存】

原包装应储存于2～8℃保鲜冷藏，切勿冷冻。

【有效期】

有效期12个月;生产日期、有效期、生产批号见外包装。