非诺特罗快速检测试剂盒说明书

                            非诺特罗快速检测试剂盒

使用说明书

【产品简介】

非诺特罗属于β-兴奋剂类药物，可提高胴体瘦肉率，曾被广泛添加于饲料中。人食用了含非诺特罗残留的动物性食品，会出现肌肉震颤、心悸、过敏、头痛目眩、恶心、呕吐、发烧、颤栗等症状，世界各国已明文禁止其使用。常规仪器检测方法不能满足实际生产中大批量检测的需求。非诺特罗快速检测试剂盒具有方便、快速、灵敏等特点，适用于大批量样品快速检测。

【测定原理】

本试剂盒采用间接竞争ELISA法检测尿样和组织等样本中的非诺特罗，在微孔条上预包被偶联抗原，利用抗原与抗体的特异性免疫化学反应的原理来进行，样本中的非诺特罗和微孔条上预包被偶联抗原竞争标记有辣根过氧化酶的抗非诺特罗抗体，通过洗涤后，用TMB底物显色，样品中的非诺特罗含量与样品的吸光度值呈反比，与标准曲线比较即可得出非诺特罗含量。

【试剂盒技术指标】   

规      格：96孔/盒

灵 敏 度： 0.5ppb

检测时间： 45min

尿      液………………………………… 1.5ppb

组      织（处理一）…………………… 1.5ppb

组      织（处理二）…………………… 0.5ppb

饲      料  …………………………………5ppb

交叉反应率：

非诺特罗（Salbutamol ）………………  100%

莱克多巴胺（Ractopamine）……………… <0.1%

样本回收率：

尿     样   ……………………… 85%±10%

组     织   ……………………… 85%±15%

饲     料   ……………………… 85%±15%

【试剂盒组成】

1、 微量测试孔：1×96孔板（12条×8孔）

2、 标准溶液X6瓶：（1ml/瓶）0ppb、0.5ppb、1.5ppb、4.5ppb、13.5ppb、40.5ppb

3、 高浓度标准品：×1瓶：（1ml/瓶） 1ppm

4、 酶标记物      7ml……………………… 红色帽

5、 抗体工作液  7ml……………………… 绿色帽

6、 底物A液     7ml  ……………………棕色帽

7、 底物B液     7ml  ……………………黑色帽

8、 终  止  液     7ml  ……………………黄色帽

9、 20X浓缩洗涤液40 ml  ………………白色帽

【 所用仪器、试剂】

具备的仪器：微孔酶标仪、氮气吹干装置、打印机、均质器 、振荡器、离心机、恒温箱、天平（感量0.0g）、刻度移液管

微量移液器：单道20µl-200µl、100µl-1000µl、多道 250µl

试          剂： 乙腈、甲醇、正己烷、无水硫酸钠

【实验前溶液配制】

配液1、将40ml浓缩洗涤液（20倍浓缩）用去离子水按照

              1：19稀释（1份浓缩洗涤液+19份去离子水），或按

             所需用量配制洗涤液。

【样本前处理步骤】

样本处理前须知处理任何样本时，都必须注意：

（a）实验中必须使用一次性吸头，在吸取不同的试剂时要更换吸头。

（c）实验前须检查各种实验器具是否干净，必要时可对实验器具进行清洁，以避免污染干扰实验结果。

（a）尿样本的处理方法

           取50µl清亮尿样直接测定（如果尿样浑浊一定要过滤或离心10min，4000r/min，直至得到清亮尿样），暂不用的样本应冷冻保存

样本稀释倍数：1

由于尿液阴性样本可能会产生背景干扰 （在某些情况下干扰数值在标准2到3之间），所以推荐标准3即1.5ppb作为尿液阳性结果的CUT OFF判断值。

（b）组织样本的处理方法一

1、  称2±0.05g组织，加入6ml去离子水，充分振荡2min，室温4000r/min以上离心10min。(注：若组织样本中油脂含量较高，可在振荡后放入85℃水浴10min后再离心)。

2、  取50µl上清液进行分析。

 样本稀释倍数：4

（c） 组织样本（肌肉和肝脏）处理方法二

1、 称取均匀后的组织样本2±0.05g ，加入6ml乙腈溶液，充分振荡2min。4000r/min以上，15℃离心10min；

2、 取上清液4ml，在56℃条件下氮气或空气流吹至完全干燥；

        肉样本：

加入1ml 去离子水混合振荡30s，取50µl用于分析。

肉样本稀释倍数：1

   肝脏样本：

加入2ml正己烷振荡溶解，再加入1ml 去离子水混合振荡30s，4000r/min以上，15℃离心5min，去除上层；取50µl下层 与50µl去离子水混匀；取50µl用于分析。

肝样本稀释倍数：2

操作步骤：

1、 将所需试剂从4℃冷藏环境中取出，置于室温（20-25℃）平衡30min以上, 注意每种液体试剂使用前均须摇匀。

2、 取出需要数量的微孔板及框架，将不用的微孔板放入自封袋，保存于2-8℃不要冷冻。

3、 编号：将样本和标准品对应微孔按序编号，每个样本和标准品做2孔平行，并记录标准孔和样本孔所在的位置。

4、 加标准品/样本50µl/孔到各自的微孔中，然后加酶标记物50µl/孔，再加入抗体工作液50µl/孔。用盖板膜封板，轻轻振荡混匀，25℃环境中反应30min。

5、 小心揭开盖板膜，将孔内液体甩干，用洗涤液250µl/孔充分洗涤4-5次，每次间隔15-30秒，用吸水纸拍干（拍干后未被清除的气泡可用干净的枪头刺破）。

6、 显色：每孔加入底物A液50µl，再加底物B液50µl，轻轻振荡混匀25℃环境避光显色15min。

7、 测定：每孔加入终止液50µl，轻轻振荡混匀，设定酶标仪于450nm处 （建议用双波长450/630nm，检测在5min内读完数据）测定每孔OD值。

【结果判定】

结果判定有两种方法，粗略判定可用第1种方法，定量判定用第2种方法。注意样本吸光值与其所含非诺特罗量成负相关。

 1、定性判定：

   用样品的平均吸光度值与标准值比较即可得出样本所含非诺特罗浓度范围（ng/ml）。假设样品1的吸光度值为0.333，样品2的吸光度值为1.032，标准液吸光度值分别是：0ppb为1.792；0.5ppb为1.501；1.5ppb为1.175； 4.5ppb为0.751； 13.5ppb为0.421；40.5ppb为0.198。则样品1的浓度范围是13.5ppb-40.5ppb；样品2的浓度范围是1.5ppb-4.5ppb。乘以其对应的稀释倍数即为样本中非诺特罗实际浓度。

2、定量判定：

    所获得每个浓度标准溶液和样本吸光度值的平均值（B）除以第一个标准（0标准）的吸光度值（B₀）再乘以100%，

B—标准溶液或样本溶液的平均吸光度值

B₀—0ng/ml标准溶液的平均吸光度值

以标准品百分吸光率为纵坐标，以非诺特罗标准品浓度（ng/ml）的半对数为横坐标，绘制标准曲线图。将样本的百分吸光率代入标准曲线中，从标准曲线上读出样本所对应的浓度，乘以其对应的稀释倍数即为样本中非诺特罗实际浓度。

若利用试剂盒专业分析软件进行计算，更便于大量样品的准确、快速分析。

3、标准准曲线：

B/B0 (%)

0.5                 1.5                   4.5                13.5             40.5

非诺特罗(ppb) [µg/kg]

                   图1：非诺特罗检测试剂盒的回归曲线

4、再现性：

        %CV

                 0           0.5           1.5            4.5          13.5          40.5

非诺特罗(ppb) [µg/kg]

图2：非诺特罗检测试剂盒的精密度

由多个不同的实验结果确定了精密度，图2显示出非诺特罗检测试剂盒的精密度情况，获得的标准吸收值的变异系数（%CV）对相应非诺特罗浓度作曲线，可以看到在全部范围内变异系数如此之低，可以得到很好的再现性。

【注意事项】

1、 使用前将所有试剂温度回升至室温20-25℃。试剂及标本没有回到室温（20-25℃）会导致所有标准的OD值偏低。

2、 在洗板过程中如果出现板孔干燥的情况，则会伴随着出现标准曲线不成线性，重复性不好的现象。所以洗板拍干后应立即进行下一步操作。

3、 混合要均匀，否则会出现重复性不好的现象。

4、 反应终止液为2M硫酸，避免接触皮肤。

5、 不要使用过了有效日期的试剂盒，稀释或搀杂使用会引起灵敏度、OD值的变化。不要交换使用不同批号的盒中试剂。

6、 不用的微孔板放进自封袋密封；标准物质和无色的发色剂对光敏感，因此要避免直接暴露在光线下。

7、 显色液若有任何颜色表明变质，应当弃之。0标准的吸光度值小于0.5个单位（A_450nm< 0.5 ）时，表示试剂可能变质。

8、 该试剂盒最佳反应温度为25℃，温度过高或过低将导致检测吸光度值和灵敏度发生变化。

【储存】

原包装应储存于2～8℃保鲜冷藏，切勿冷冻。

【有效期】

有效期12个月;生产日期、有效期、生产批号见外包装。