【阿拉丁】Triton X-114相分离法去除蛋白样品内毒素（LPS）

1.目的：

        利用Triton X-114的温度依赖性相分离特性，有效去除水溶性蛋白样品中的内毒素（脂多糖，LPS），同时保留目标蛋白在水相中。

2.原理：

        Triton X-114在低温（0–4°C）时完全溶于水，形成均一溶液；加热至其浑浊点（cloud point,~22°C）以上时，溶液发生相分离，形成密度较大的去污剂相和密度较小的水相。疏水性的内毒素倾向进入去污剂相，而大多数亲水性蛋白保留在水相中。离心可加速相分离，收集水相即获得低内毒素蛋白。

图一 Triton X-114化学结构式

3.材料与试剂

        含内毒素的蛋白样品（如重组蛋白、抗体）

        低内毒素级Triton X-114（T101474）

        低内毒素缓冲液（PBS P397924、Tris-HCl T301491等），pH适宜蛋白稳定

        冰浴（0–4°C）

        可控温水浴（30–37°C）

        预冷离心机

        离心管（1.5 mL、15 mL等，根据样品体积选择）

        移液器及低吸附移液枪头

4.仪器设备

        温控离心机

        精准水浴或恒温加热块

        冰桶

5.实验前准备

        预冷设备：将离心机转头及离心管置于4°C预冷。

        配制Triton X-114储备液：将低内毒素Triton X-114溶解在低内毒素缓冲液中，配制10–20%(w/v)储备液，澄清后储存4°C。

        样品缓冲液兼容性：避免高甘油、蔗糖、强变性剂或其他去污剂，必要时进行透析或稀释。

6.操作步骤

步骤1：加入Triton X-114并混匀

        将Triton X-114储备液加入蛋白样品中，轻柔混匀，形成均一透明溶液，使Triton 与内毒素充分接触。操作温度保持在0–4°C，立即混匀。注意避免产生气泡，保证混合均匀。

步骤2：冷孵育

        在0–4°C冰浴中孵育5–15分钟，使Triton X-114与内毒素充分作用。确保冰浴温度稳定，以达到最佳效果。

步骤3：热孵育诱导相分离

        将样品转移至30–37°C水浴中孵育5–10分钟，直至溶液出现浑浊，形成去污剂微滴和水相，实现LPS分配。温度需精确控制，保证相分离效果。

步骤4：离心分离

        在30–37°C条件下，10,000–15,000×g离心5–10分钟，加速相分离。离心后溶液通常分为三层：上层水相（含目标蛋白）、下层去污剂相（含内毒素）、界面层（含杂质）。注意温度需与热孵育保持一致。

步骤5：收集水相

        小心吸取上层水相，转移至干净预冷离心管，通常回收90–95%的体积。避免扰动下层和界面层，以减少杂质污染。

步骤6：去除残留Triton X-114（可选）

        如对Triton敏感，可重复步骤1到步骤5两到四次，或使用超滤、透析（选用适当MWCO膜）或专用树脂吸附，降低Triton残留。

步骤7：验证

        对处理后的蛋白样品进行内毒素检测（LAL法）、蛋白浓度测定（BCA或Bradford法）以及蛋白活性或结构完整性检测，确保实验效果。

7.注意事项与优化建议

8.总结

        Triton X-114相分离法是一种经济、有效的亲水性蛋白去内毒素方法。成功关键在于：低内毒素Triton X-114、精确温控、界面小心操作、多次循环及最终内毒素检测。

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