【小优细节君】胶原蛋白为何难检测？WB没有条带、分子量也不对……

胶原蛋白是哺乳动物中是最重要的结构蛋白，也是细胞外基质（ECM）的主要成分。胶原蛋白在食品、化妆品、制药和生物医学行业中都有许多应用，同时与纤维性疾病息息相关。胶原蛋白及其他细胞外基质的过度沉积是器官纤维化的标志，纤维化会导致肺、肝、肾等器官的衰竭^[1]。此外，胶原蛋白还与肿瘤形成有关，刺激原胶原赖氨酸作为胶原交联剂的表达会增加胶原纤维的大小，促进癌症扩散。而癌细胞中的胶原蛋白含量也影响其对化疗的耐药性^[2]。研究胶原蛋白的结构特征及其在癌症中的作用对于推进新的治疗方法有积极的推动作用。然而在胶原蛋白的研究检测中，大家常常会遇到这样那样的问题：WB实验无条带、分子量不正确……今天小优细节君就和大家一起探讨在WB检测中怎么样才能获得理想的胶原蛋白条带。

1  胶原蛋白结构与分类

胶原蛋白由三螺旋区和螺旋两端的两个非螺旋区组成。三螺旋构象是所有胶原的决定性结构元素（图1a），胶原三螺旋（三级结构）具有由三条平行的α多肽链（二级结构）组成的螺旋状结构，这些链以规则的螺旋相互缠绕，由氢键连接，形成绳状结构（图1b）^[3]。

Fig. 1 胶原蛋白结构示意图

迄今为止，人们已经发现了20多种不同类型的胶原蛋白，分别以罗马数字命名为I型、II型、III型、IV型……其中，前五种胶原蛋白更易于提取，而I型胶原蛋白作为细胞外关键构成成分，在体内含量最为丰富，因此研究较多。

I型胶原蛋白的结构符合胶原蛋白家族的典型特征：含有一段(Gly-X-Y)n重复序列的三聚体结构，在C端与Ｎ端的２个前肽形成非螺旋区，位于(Gly-X-Y)n重复序列两侧，成为NC结构域。NC结构域可以进一步折叠成球状结构。I型胶原蛋白分泌到胞外基质后，经剪切除去C与Ｎ-前肽，得到成熟的胶原蛋白。

2  检测方法

通过前面的介绍，我们已经对胶原蛋白有了大致的了解，那么在进行WB实验检测胶原蛋白时有哪些需要特别注意的地方呢。有研究表明样品的处理、凝胶的选择都有可能对结果呈现产生影响，Victoria J. Iannarone就从上样前处理、凝胶浓度等方面进行对比实验，探究上样前煮沸、是否加入BME以及SDS添加水平对于I型胶原蛋白检测的影响，下面我们就一起来看一看。

首先检测了完全不加入SDS的情况下，在8%Tris-甘氨酸凝胶、6%Tris-甘氨酸凝胶或4%–12%Tris-甘氨酸凝胶中不煮沸和无BME条件下的比目鱼肌肉提取I型胶原蛋白（Fig2A的2泳道、Fig2B的2＆3泳道、Fig2C的5泳道），发现均可检测到~240 kDa以上的条带。

然后改变上样前处理方式，上样前煮沸并添加BME（Fig2C的2泳道），不煮沸但添加BME（Fig2C的3泳道），煮沸但不添加BME（Fig2C的4泳道）和不煮沸和不添加BME（Fig2C的5泳道），发现煮沸的样本无论是否添加BME，泳道无内均无信号。而不煮沸时，不添加BME的样本中信号强于添加BME的样本。

Fig 2. 不同浓度凝胶检测比目鱼肌肉样本I型胶原蛋白结果

前组结果展示了完全无SDS添加的条件下，I型胶原蛋白的检测结果。接下来，改变SDS添加，分别使用含有或不含SDS的8%Tris-甘氨酸凝胶，检测样本中的I型胶原蛋白，并在样品和电泳缓冲液中添加SDS，使蛋白部分变性，以期实现I型原胶原和成熟胶原检测。

Fig3A与3B对比可以看出当仅在样本及电泳液中添加SDS时，靶标条带的呈现更加清晰单一，背景也更加干净。

在凝胶中无SDS时，可以看出煮沸并添加BME使I型胶原蛋白信号完全丧失（Fig3B的2泳道）， 而仅添加BME或仅煮沸则可检测到130kd以下的信号，代表变性和水解的胶原多肽^[4]。同时，添加BME的样本对于130kd以上前胶原的呈现更弱一些。

用BME煮沸时，相同的肌肉裂解物在~50kDa处显示出微弱的胶原蛋白裂解产物带（图3A，泳道3），代表变性和水解的胶原蛋白多肽^[13]。在泳道3的样品中添加BME降低了检测在泳道4和5中可观察到的~130 kDa以上的前胶原条带的能力，前胶原在非还原条件下更易检出。

Fig 3. 不同SDS水平检测比目鱼肌肉和酸纯化大鼠尾I型胶原蛋白结果(2-5为比目鱼肌肉样本，7-10为酸纯化大鼠尾样本)

为了进一步前胶原的实验条件，换用4%–12%的不含SDS的Tris-甘氨酸凝胶以期获得更好的分离效果。结果进一步验证了前胶原在非还原条件下更易检出（Fig4A的4、5、9、10泳道）。煮沸同时添加BME会导致肌肉裂解物中靶标信号丢失，而煮沸或添加BME则会使胶原裂解物增加（Fig4的3和4泳道）。

Fig 4. 4-20%不含SDS凝胶检测比目鱼肌肉和酸纯化大鼠尾I型胶原蛋白结果(2-5为比目鱼肌肉样本，7-10为酸纯化大鼠尾样本)

综合上述结果，我们可以发现I型前胶原在适当变性（凝胶中无SDS、样品及buffer中添加SDS）、非还原（不煮沸、不添加BME）条件下更容易检出，I型胶原成熟体在适当变性、以及添加BME（不煮沸）条件下更容易检出。

当然在针对具体样本的检测时可能也会有不一样的结果呈现，在进行I型胶原蛋白的检测时，可以参考上述条件，选择合适的方式进行检测。同时也启发我们在进行其他实验时，也可以根据实际的研究目的以及样本的特性，有选择地调整相关实验条件，从而更好的呈现研究结果。

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参考文献：

[1] Zuo S, Wang B, Liu J, Kong D, Cui H, Jia Y, Wang C, Xu X, Chen G, Wang Y, Yang L, Zhang K, Ai D, Du J, Shen Y, Yu Y. ER-anchored CRTH2 antagonizes collagen biosynthesis and organ fibrosis via binding LARP6. EMBO J. 2021 Aug 16;40(16):e107403. doi: 10.15252/embj.2020107403. Epub 2021 Jul 5. PMID: 34223653; PMCID: PMC8365266.

[2] Angre T, Kumar A, Singh AK, Thareja S, Kumar P. Role of Collagen Regulators in Cancer Treatment: A Comprehensive Review. Anticancer Agents Med Chem. 2022;22(17):2956-2984. doi: 10.2174/1871520622666220501162351. PMID: 35490431.

[3] Sorushanova A, Delgado LM, Wu Z, Shologu N, Kshirsagar A, Raghunath R, Mullen AM, Bayon Y, Pandit A, Raghunath M, Zeugolis DI. The Collagen Suprafamily: From Biosynthesis to Advanced Biomaterial Development. Adv Mater. 2019 Jan;31(1):e1801651. doi: 10.1002/adma.201801651. Epub 2018 Aug 20. PMID: 30126066.

[4] Gorgieva S, Kokol V (2011) Collagen- vs. gelatine-based biomaterials and their biocompatibility: Review and perspectives. IntechOpen. doi: 10.5772/24118.

[2] Role of Collagen Regulators in Cancer Treatment: A Comprehensive Review

PMID: 35490431

DOI: 10.2174/1871520622666220501162351

[3] The Collagen Suprafamily: From Biosynthesis to Advanced Biomaterial Development

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