抗猪星状病毒（PAV）单克隆抗体毒株型号、抗体特性、制备方法、特异性参数

抗猪星状病毒（Porcine Astrovirus, PAV）单克隆抗体在病毒检测、致病机制研究及疫苗开发中具有关键作用。以下从毒株型号、抗体特性、制备方法、特异性参数及应用场景等方面详细说明相关参数：

一、猪星状病毒主要毒株型号及抗原特性

（一）基因型与代表毒株

猪星状病毒根据衣壳蛋白（Cap）基因差异分为多个基因型，常见毒株如下：

（二）关键抗原蛋白

• 衣壳蛋白（Cap）：
  • 由 VP1、VP2、VP3 亚基组成，表面暴露的高变区（Hypervariable Region, HVR） 和保守结构域（如 β- 桶状核心） 是抗体识别的主要区域。
  • PAV-1 的 Cap 蛋白在氨基酸序列上与 PAV-5 同源性约 55%，但构象表位存在差异，需针对不同基因型设计抗体。

二、单克隆抗体的核心参数

（一）抗体亚型与表位特异性

（二）制备方法与关键参数

1. 杂交瘤细胞株构建：

   • 免疫原：重组 Cap 蛋白（如 PAV-1 Cap 的 1-300aa 片段，原核表达后纯化）或灭活病毒颗粒（OSU 株）。
   • 融合细胞：SP2/0 骨髓瘤细胞与免疫小鼠（BALB/c）的脾细胞融合，通过有限稀释法筛选阳性克隆。
   • 抗体纯化：Protein A/G 亲和层析，纯度＞95%，内毒素＜0.1 EU/mg。

2. 特异性验证指标：

   • 交叉反应：
     • 与猪轮状病毒（PoRV）、猪流行性腹泻病毒（PEDV）等肠道病毒无交叉反应（ELISA 检测 OD 值＜0.1）。
     • 与同属其他动物星状病毒（如人星状病毒、牛星状病毒）交叉反应率＜1%。
   • 中和活性：通过空斑减少试验（Plaque Reduction Neutralization Test, PRNT）测定，中和抗体对同源毒株（如 PAV-1 OSU 株）的中和效价≥1:128。

三、应用场景与技术参数

（一）检测方法中的应用

1. ELISA 检测：
   • 包被抗体：3B5 株单抗（10 μg/mL），检测抗体：HRP 标记的 5E8 株单抗（1:5000 稀释），检测限（LOD）=10 ng/mL PAV 抗原。
2. 免疫荧光（IFA）：
   • 抗体浓度：10 μg/mL，可识别感染 PAV 的 Vero 细胞内病毒抗原，荧光强度（MFI）＞10³。
3. Western blot：
   • 识别 Cap 蛋白（约 38 kDa），特异性条带信号 / 背景比（S/B）＞5:1。

（二）中和试验与疫苗研究

• 中和机制：中和型单抗通过阻断 Cap 蛋白与宿主细胞受体（如衰变加速因子 DAF）的结合，抑制病毒入侵。
• 疫苗评价：在疫苗效力试验中，单抗可用于检测免疫动物血清中的中和抗体滴度，评估疫苗诱导的保护性免疫应答。

四、注意事项

1. 基因型特异性：由于 PAV 不同基因型 Cap 蛋白抗原差异较大，建议根据目标毒株（如 PAV-1 或 PAV-5）选择对应的单克隆抗体。
2. 交叉反应限制：部分广谱单抗可能与猪肠道共生菌（如大肠杆菌）表面蛋白存在低水平交叉反应，需通过阴性血清吸附法排除干扰。
3. 保存条件：抗体冻存液（含 50% 甘油）于 - 20℃可保存 2 年，避免反复冻融；工作液（PBS 稀释）4℃可保存 2 周。