上海阿拉丁生化科技股份有限公司

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         细胞冻存是一种将细胞在低温条件下保存的方法，目的是在长时间内保持细胞的活性和功能。这种方法对于细胞系的长期保存、实验重复性、基因库的建立以及细胞治疗的储备等都具有重要意义。通过冻存，可以减少细胞在传代过程中的遗传变异，避免因污染、环境变化或实验操作失误导致的细胞损失。最佳的冷冻保存时机是在细胞处于最佳生长速度时。

         冷冻保护剂是细胞冻存中的关键成分，常用的冷冻保护剂包括二甲基亚砜（DMSO）和甘油。这些保护剂的主要作用是降低溶液的冰点，减少冰晶的形成，从而保护细胞免受冰晶的机械损伤。DMSO是一种常用的冷冻保护剂，适用于大多数细胞类型，但某些细胞对DMSO敏感，此时可以使用甘油作为替代品。

第 1 阶段   冷冻保存

实验步骤

1.在冷冻管上标记日期、研究人员姓名、细胞编号、传代数和细胞类型（以及任何其他有用信息，例如基因改造）。

2.如果是贴壁细胞，先除去细胞培养基，用PBS清洗，添加适量的胰蛋白酶以覆盖细胞，并在37°C培养箱中孵育约2分钟（具体孵育时间应根据实际培养的细胞类型决定）。

         添加等量的培养基终止消化作用，用移液枪轻轻吹打细胞，将贴壁细胞冲洗下来，并转移到50 mL Falcon管中。

3.对于悬浮培养细胞，将所需体积的细胞直接转移到50 mL Falcon管中。

4.使用血细胞计数器计数细胞以确定其活力。冷冻保存的细胞活力应至少为75%。

5.室温下以300 × g离心5分钟。

6.准备冷冻培养基（见表1）。

         表 1. 不同哺乳动物细胞系适用的冻存培养基配方：

         使用前混合均匀并加热至 37°C。

         冷冻培养基含有必需的冷冻保护剂，例如二甲基亚砜（DMSO），以防止形成可能损害细胞膜和成分的细胞内和细胞外冰晶。

         注意，DMSO并不适合所有细胞类型，有些情况下，可以使用甘油作为替代品。

7.除去上清液。

8.加入冻存培养基至所需细胞密度。

         对于哺乳动物细胞，该浓度通常为 1×106/mL 冻存液。细胞在冻存液中在室温下放置的时间不应超过10分钟。

9.将1 mL样品分装到冷冻管中，并盖紧盖子。

10.将冷冻管转移至室温的冷冻盒中，再放入-80°C的冰箱。冷冻盒外周添加适量异丙醇，确保温度以每分钟1°C的速度稳定下降。

         由于冷冻前，会有较多的水流出，因此缓慢的冷冻过程（每分钟-1ºC）有助于防止细胞内冰晶的形成。

11.约24小时后，从冷冻盒中取出冷冻管并转移到液氮中长期储存。

         一般冷冻的细胞可以在液氮中保存数年。理想情况下，冷冻细胞不应在-80ºC下保存很长时间（最多一周），并且应尽快转移到液氮中。在-80ºC下长期储存细胞可能会损害细胞活力。

第 2 阶段   解冻冷冻细胞系

实验步骤

1.从液氮储存器中取出冷冻管。快速放入37°C水浴中，直至解冻约80%（请勿在室温下解冻）。此过程不应超过1分钟。

         因为缓慢的解冻过程会对细胞造成损坏，所以细胞通常应尽快解冻。

         同时，冷冻保护剂DMSO具有一定的细胞毒性，因此细胞应以比室温下更快的速度解冻，以便快速稀释和去除DMSO。

         快速解冻细胞的另一个目的是防止冷冻过程中形成的任何晶体损坏细胞膜或成分。

2.使用移液器将冷冻管中的物质转移到含有约10 mL预热培养基的15 mL Falcon 管中。

3. 300 × g离心5分钟，弃上清液，用适量培养基重悬细胞沉淀。

4.将细胞悬液转移到培养容器中。然后转移到37°C培养箱中，培养。

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