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磷酸化EGFR (Y1068) 检测试剂盒是一种均相的时间分辨福斯特共振能量转移（TR-FRET）夹心免疫分析。THUNDER™细胞信号检测工作流程包括三个步骤。在细胞处理后，首先使用试剂盒中提供的特定裂解缓冲液对细胞进行裂解。然后，利用一对荧光标记抗体在简单的“添加-孵育-测量”格式中检测细胞裂解液中的磷酸化EGFR (Y1068)（单步试剂添加；无需洗涤步骤）。其中一种抗体用供体荧光染料（铕螯合物；Eu-Ab1）标记，另一种则用远红色受体荧光染料（FR-Ab2）标记。两种标记抗体与目标蛋白上不同的表位结合，发生在溶液中，使两种染料靠近。用闪光灯（320或340 nm）或激光（337 nm）激发供体铕螯合物分子后，会触发从供体到受体分子的FRET，进而在665 nm处发出TR-FRET信号。铕螯合物残余能量会在615 nm处产生光信号。665 nm处的信号与细胞裂解液中磷酸化EGFR (Y1068) 的浓度成正比。数据可以表示为665 nm处的信号或665 nm与615 nm的比值。

艾美捷BioAuxilium-THUNDER磷酸化EGFR(Y1068)TR-FRET细胞信号检测试剂盒#KIT-EGFRP-100组成：

Eu-磷酸化EGFR（5 µL）

Acc-磷酸化EGFR（20 µL）

EGFR对照裂解液（100 µL）

5倍裂解缓冲液1（1 mL）

10倍TR-FRET检测缓冲液（50 µL）

100倍磷酸酶抑制剂混合液（50 µL）

互补试剂：

THUNDER™ EGFR对照裂解液

THUNDER™裂解缓冲液1（5倍）

THUNDER™ TR-FRET检测缓冲液（10倍）

THUNDER™磷酸酶抑制剂混合液（100倍）

验证数据

本试剂盒已通过验证，可用于使用2板检测协议对A431细胞裂解液中磷酸化EGFR (Y1068) 的相对定量检测。

细胞培养：贴壁细胞在96孔细胞培养板中过夜培养（DMEM + 10% FBS）。

细胞处理：细胞处理后，移除培养基，用1X裂解缓冲液1（50 µL）裂解细胞，裂解缓冲液中补充了稀释1倍的100倍磷酸酶抑制剂混合液。

孵育与检测：在室温下于振荡器（400 rpm）孵育30分钟后，将裂解液（15 µL）转移至384孔检测板，并加入标记抗体Eu-Ab1和FR-Ab2（5 µL）用于检测磷酸化EGFR (Y1068)。

信号读取：在室温孵育1小时后，记录665 nm和615 nm处的TR-FRET信号（EnVision®；灯激发）。

实验数据：

A431细胞（每孔4万细胞，三重复）与EGF的系列稀释液在室温下孵育10分钟。数据显示，EGF处理可刺激A431细胞中EGFR在Y1068位点的磷酸化。

A431细胞（每孔4万细胞，三重复）与Cetuximab的系列稀释液在室温下孵育30分钟，随后用50 nM EGF在室温下刺激10分钟。数据显示，Cetuximab处理可抑制EGF诱导的A431细胞中EGFR在Y1068位点的磷酸化。

A431细胞（每孔4万细胞，三重复）分别在有无50 nM EGF的条件下在室温下孵育10分钟。每组处理使用48个孔来确定Z'因子值。Z'因子值为0.73，表明该检测方法稳健且适用于高通量筛选（HTS）。

磷酸化EGFR (Y1068) 检测试剂盒常规测试使用EGF处理的A431细胞裂解液。A431细胞在T175培养瓶中培养至100%汇合，用100 nM EGF在室温下刺激10分钟。细胞裂解后，用1X裂解缓冲液1对裂解液进行系列稀释，并进行三重复检测。数据显示，裂解液稀释度与TR-FRET比值呈线性关系。

艾美捷科技是BioAuxilium的中国区域合作伙伴，为科研工作者提供优质的产品与服务。

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