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磷酸化BTK (Y223) 检测试剂盒是一种均相的时间分辨福斯特共振能量转移（TR-FRET）夹心免疫分析。THUNDER™细胞信号检测工作流程包括三个步骤（见图2）。在细胞处理后，首先使用试剂盒中提供的特定裂解缓冲液对细胞进行裂解。然后，在简单的“添加-孵育-测量”格式中，利用一对荧光标记抗体检测细胞裂解液中的磷酸化BTK (Y223)（单步试剂添加，无需洗涤步骤）。其中一种抗体用供体荧光染料（铕螯合物；Eu-Ab1）标记，另一种则用远红色受体荧光染料（FR-Ab2）标记。

艾美捷BioAuxilium-THUNDER 磷酸化BTK (Y223)时间分辨荧光共振能量转移细胞信号检测试剂盒#KIT-BTKP-100检测原理：

这两种标记抗体与目标蛋白上不同的表位结合，发生在溶液中，使两种染料靠近。用闪光灯（320或340 nm）或激光（337 nm）激发供体铕螯合物分子后，会触发从供体到受体分子的FRET，进而在665 nm处发出TR-FRET信号。铕螯合物残余能量会在615 nm处产生光信号。665 nm处的信号与细胞裂解液中磷酸化BTK (Y223) 的浓度成正比。数据可以表示为665 nm处的信号或665 nm与615 nm的比值。

试剂盒组成：

Eu-Phospho-BTK（5 µL）

Acc-Phospho-BTK（20 µL）

BTK对照裂解液（500 µL）

5倍裂解缓冲液2（1 mL）

10倍TR-FRET检测缓冲液（50 µL）

100倍磷酸酶抑制剂混合液（50 µL）

互补试剂：

THUNDER™裂解缓冲液2（5倍）

THUNDER™ TR-FRET检测缓冲液（10倍）

THUNDER™磷酸酶抑制剂混合液（100倍）

验证数据：

本试剂盒已通过验证，可用于使用2板检测协议对Raji细胞裂解液中磷酸化BTK（Y223）的相对定量检测。

细胞培养：非贴壁细胞在RPMI+10% FBS中培养，随后经过离心并重悬于无血清的RPMI中，达到所需密度。

细胞处理：细胞处理后，使用5倍裂解缓冲液2（最终浓度为1倍）裂解细胞，裂解缓冲液中补充了稀释5倍的100倍磷酸酶抑制剂混合液。

孵育与检测：在室温下于振荡器（400 rpm）孵育30分钟后，将裂解液（15 µL）转移至384孔检测板，并加入标记抗体Eu-Ab1和FR-Ab2（5 µL）用于检测磷酸化BTK（Y223）。

信号读取：在室温孵育4小时后，记录665 nm和615 nm处的TR-FRET信号（EnVision®）。

实验数据：

在96孔细胞培养板中，Raji细胞（每孔20万细胞，三重复）与Pervanadate的系列稀释液在37℃下孵育30分钟。数据显示，Pervanadate处理可刺激Raji细胞中BTK在Y223位点的磷酸化。

Raji细胞（每孔20万细胞，三重复）与Ibrutinib的系列稀释液在37℃下孵育60分钟，随后用150 µM Pervanadate在37℃下刺激30分钟。数据显示，Ibrutinib处理可抑制Pervanadate诱导的Raji细胞中BTK在Y223位点的磷酸化。

Raji细胞（每孔20万细胞）分别在有无200 µM Pervanadate的条件下在37℃下孵育30分钟。每组处理使用48个孔来确定Z'因子值。Z'因子值为0.74，表明该检测方法稳健且适用于高通量筛选（HTS）。

Phospho-BTK (Y223)检测试剂盒常规测试使用Pervanadate处理的Raji细胞裂解液。Raji细胞经培养、离心后，以1000万细胞/mL的密度重悬，并用200 µM Pervanadate在37℃下刺激30分钟。细胞裂解后，用5倍裂解缓冲液2（最终浓度：1倍）对裂解液进行系列稀释，并进行三重复检测。数据显示，裂解液稀释度与TR-FRET比值呈线性关系。

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