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ELISA

前置知识：

ELISA（酶联免疫吸附试验）是一种常用的实验技术，主要用于检测和定量分析样品中的特定抗原或抗体。它基于免疫学原理，具有高灵敏度和高特异性。

ELISA 实验一般包含以下步骤：

1. 涂覆：把待检测的抗原或抗体溶液加入微孔板（通常为 96 孔板），使其在孔板表面形成固定的抗原或抗体层。

2. 阻断：涂覆后，加入阻断剂如牛血清蛋白（BSA）或牛奶粉，覆盖孔板上未被固定的表面，以减少非特异性结合，降低背景信号。

3. 样品加入：将待测样品加到微孔板中，让样品中的目标抗原或抗体与固定在孔板上的抗体或抗原相互作用。

4. 洗涤：反复洗涤孔板，去除未结合的物质，从而减少背景信号。

5. 探针加入：加入与待测物特异性结合的酶标记二抗（如辣根过氧化物酶 - HRP）或酶标记抗原，使其与样品中的目标物结合。

6. 洗涤：再次洗涤孔板，去除未结合的酶标记物。

7. 底物加入：加入一种底物，该底物能与酶标记物相互作用，产生可测量的信号。常用的底物是可被酶催化产生颜色或荧光的物质。

8. 反应停止：加入停止剂，停止底物的反应，防止信号进一步增加。

9. 信号测量：使用光谱仪或荧光测量仪测量底物反应产生的信号，依据信号强度确定样品中目标物的浓度。

问题：ELISA 空白背景高的常见原因及处理方法

一般情况下，阴性孔吸光光度值不应超过 0.1。

常见原因如下：

1）洗板不彻底

解决方法：

①进行充分洗涤，若洗板时间不足会导致抗体残留使阴性对照显色，可尝试延长洗板时间、增加洗板频率，并在洗液中加入表面活性剂 Tween - 20。洗板时要确保每一步都完全洗涤，充分拍板至孔内无明显残留液体。

②避免交叉污染，弃去洗液和孵育抗体时防止交叉污染，移液枪头尽量一次性使用，拍板的滤纸不可反复使用。

2）显色液变质或试剂过期

解决方法：检查试剂盒有效期，或使用新的试剂盒并按说明书要求保存。每次剩余的显色液最好不回收，或只回收用洗净容器装的显色液。

3）试剂稀释错误，检测抗体 / 酶结合物工作液浓度过高

解决方法：按照说明书推荐的稀释倍数稀释抗体。

4）试剂盒组分未平衡

解决方法：试剂盒各组分需平衡至室温后再进行实验。

5）混用其他试剂盒试剂

解决方法：确保使用试剂盒内完整的一套试剂进行实验，不同品牌及不同批次的试剂可能不匹配，不同批号试剂不要混用。

6）蒸馏水受酶等污染

解决方法：使用新鲜蒸馏水。

7）培养箱温度超过 37℃或反应时间过长

解决方法：孵育时间过长、温度过高可能致使非特异性结合增加，造成本底增高。检查恒温箱，确保孵育温度稳定在 37℃，按照说明书的反应时间进行孵育。

8）酶标板底部有污渍

解决方法：加完终止液后、检测前，用 75% 乙醇浸润的脱脂棉球擦拭酶标板底部，确认无污渍后再检测。

9）洗液被污染

解决方法：洗液现配现用，长期放置可能析出或被污染，导致背景偏高。

10）包被的抗原被污染

解决办法：仔细回顾操作过程，更换新的抗原包被。

11）封闭液、封闭时间、封闭液浓度问题

解决办法：封闭液（BSA）可能与抗体产生交叉反应。封闭液浓度偏低、封闭时间过短会导致封闭不彻底，抗体与酶标板结合，可能使背景偏高，可适当调整封闭液浓度和时间以降低背景。

12）抗体质量差或选择不当

解决办法：抗体质量不高、特异性不好可能与封闭液（BSA）产生交叉反应，可用 0.8% 明胶（明胶不含血清成分）替代。若选择多克隆抗体孵育，可能与酶标单抗产生交叉反应导致背景增加，最好选用与酶标单抗同种属的多克隆抗体。

13）酶标仪设置参数错误

解决办法：检查酶标仪设置的波长，不同波长下样品吸光光度值差别很大，按照说明书要求设置参数。

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