上禾生物简讯--复方金银花中绿原酸提取工艺的研究

通过对金银花、蒲公英、连翘、紫花地丁、丹参五味中药组成的复方(自拟方)分别采取水提、水醇提取、醇水提取、超声波强化浸出四种不同的提取方法,建立紫外分光光度法,在327 nm波长处测定四种提取方法中绿原酸的含量分别为10. 0167、6. 9333、7. 400、9. 6333 mg/g原药材;绿原酸提取率分别为32. 52%、22. 52%、24. 03%、31. 28%;得膏率分别为25. 3%、18. 70%、14. 0%、16. 4%。结果水提和超声波强化浸出两种工艺提取效果较好。

关键词: 金银花;绿原酸;提取工艺

金银花的有效成分主要是绿原酸与异绿原酸等[ 1, 2 ] ,而蒲公英中也分得绿原酸,并将其含量作为蒲公英药材及其中成药制剂的质量控制[ 3 ] ,该成分对奶牛乳房炎病原体具有明显的抑制作用。因此,进行绿原酸提取工艺的研究,筛选提取工艺,以确保金银花及其制剂的临床疗效具有重要意义。该实验以绿原酸提取率和得膏率作为考核指标,考察了不同的提取工艺。

上禾生物简讯--复方金银花中绿原酸提取工艺的研究

1　仪器与药品

岛津分光光度计(UV - 120 - 02) 、KQ3200超声波清洗器、电子分析天平、电热恒温水浴锅、回流装置、真空冷冻干燥机(ALPHA I - 5) 、离心机等。绿原酸对照品由中国药品生物制品检定所提供,批号0753 - 200111。甲醇、95%乙醇均为分析纯,蒸馏水。金银花(巨鹿) 、蒲公英(黑龙江) 、连翘(山西) 、丹参(河北) 、紫花地丁(黑龙江) 。

2　方法与结果

2. 1　提取工艺及干浸膏的制备

2. 1. 1　水提工艺　将蒲公英、金银花、连翘、丹参、紫花地丁加8倍量水(125 + 8) ,不浸泡,直接煎煮2次,每次1 h,合并提取液,纱布脱脂棉滤过, 2 000 r/min离心10 min,取上清液,常压加热(70～80 ℃)浓缩至稠膏状,于60 ℃真空干燥,得干浸膏。

2. 1. 2　水醇法　将蒲公英、金银花、连翘、丹参、紫花地丁加8倍量水,煮沸2次,每次1 h,合并两次提取液,纱布脱脂棉过滤,加热浓缩至每毫升相当于原药材1 g (70～80 ℃) 。加95%乙醇,使溶液含醇量达85% ,放置过夜,取上层醇液,下层2 000 r/min离心10 min,取上清液与前液合并,回收乙醇浓缩至无醇味呈稠膏状,于60 ℃真空干燥,得干浸膏。

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2. 1. 3　醇水法　将蒲公英、金银花、连翘、丹参、紫花地丁分别粉碎过24目筛,混匀,取粗粉125 g,先用适量95%乙醇浸湿,再按6倍量用95%乙醇,回流提取2次,每次1 h,合并醇提液,浓缩回收乙醇至无醇味,加4倍药量的水,放置过夜,滤取上清液,下层2 000 r/min离心10 min,取上清液与前液合并,浓缩至稠膏状,于60 ℃真空干燥,得干浸膏。

2. 1. 4　超声波强化浸出法　将蒲公英、金银花、连翘、丹参、紫花地丁分别粉碎过24目筛,混匀,取粗粉125 g,置于有盖容器中(用广口瓶) ,加入70%乙醇625 ml,密封,置超声清洗机 (工作频率为50 kHZ,输出功率120W,温度60 ℃)的清洗糟内水溶液中,超声浸出2 h,停机,倾取上层清液,用纱布过滤,残渣用力压榨(用瓶子挤压) ,压出残液,与滤液合并,浓缩回收乙醇至无醇味呈稠膏状,于60 ℃真空干燥,得干浸膏。

2. 1. 5　4种不同提取方法所得干浸膏率见表1。

2. 2　绿原酸含量测定

2. 2. 1　标准曲线　回归方程的建立、精密称取绿原酸对照品4 mg,置棕色量瓶中,加50%甲醇溶液100 ml至刻度,然后再梯度稀释,使每1 ml含绿原酸0. 04、0. 02、0. 01、0. 005mg系列浓度,即得标准品溶液(10 ℃以下保存) 。采用紫外分光光度法,在310～340 nm波长处测定其吸光度,以波长为横坐标,吸光度为纵坐标,得吸收曲线, 327 nm为吸收波长(见图1) 。

在波长327 nm处测定四种浓度的绿原酸吸光度(A) 。用已知浓度C1、C2、C3、C4 为横坐标, A1、A2、A3、A4 为纵坐标,绘制标准曲线, 得回归方程: y = 37. 176x - 01033, r =

019995 ( n = 4) ,由此可见,绿原酸含量在0. 04～0. 005 mg/ml之间呈良好的线性关系(见图2) 。

2. 2. 2　精密度试验　按上法对同一标准品溶液平行测定5次,其绿原酸含量的RSD为1.95% ,表明本法具有较好的精密度。

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2. 2. 3　不同提取工艺供试品溶液的制备　分别取不同工艺相当于原药材0. 5 g的复方中药干浸膏,精密称定,置25ml棕色容量瓶中,加50%甲醇约20 ml,超声处理30 min,冷却,加50%甲醇至刻度,摇匀, 4 000 r/min离心10 min,精密量取上清液5 ml,置50 ml棕色容量瓶中,加50%甲醇至刻度,摇匀,作为不同提取工艺供试品溶液。

2. 2. 4　复方中药对照品药材溶液的制备　取复方中药对照品药材5 g,精密称定,置具塞锥形瓶中,精密加50%甲醇500 ml,称定重量,超声处理30 min,冷却,再称定重量,用50%甲醇补足减失的重量,摇匀,过滤, 4 000 r/min离心10 min,精密量取上清液5 ml,置50 ml棕色容量瓶中,加50%甲醇至刻度,摇匀,作为复方中药对照品药材溶液。

在327 nm波长处测定吸光度,依回归方程计算样品和对照品药材中绿原酸的含量,以水提工艺和超声波强化浸出法绿原酸的提取率较高。结果见表2。

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3　讨论

3. 1　四种方法所得干浸膏率以水提工艺较高,因为在水煮过程中,有效成分提取出来的同时,许多杂质如淀粉、多糖类、蛋白质、黏液质、鞣质、树胶、无机盐类等也被提取出来,尽管通过离心除去大部分,但仍有少量留在了提取液中;其次是水醇法,因药材水煮后,加入乙醇可将部分或大部分淀粉、多糖、蛋白质沉淀除去,但对鞣质、色素、树脂等不易除去,留在了提取液中。

3. 2　四种方法绿原酸的提取率均低,但以水提工艺和超声波强化浸出法相对较高。由于绿原酸的化学性质稳定性差,在提取过程中受时间、温度、浓缩方式等影响较大,使其在原药材中的含量损失随温度升高、时间延长而逐步增加[ 1, 5 ]。

所以,对金银花、蒲公英这样已经明确有效成分和防治功效的中草药,应该利用现代生物学技术,对其有效成分进行提取、分离。这样既有利于有效成分药理作用机制的研究,又能提高中草药制剂的质量。

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