上海宾穗生物科技有限公司

"NCI-H1184细胞：人肺癌细胞系
细胞背景资料：详见相关文献介绍
细胞形态：上皮细胞样
细胞生长：贴壁
细胞物种来源：人源或鼠源等其它物种来源
细胞产品包装：复苏形式：T２５培养瓶(一瓶)或冻存形式：１ml冻存管(两支)
细胞传代方法：１：２-１：３传代；每周换液２-３次。
细胞来源说明：细胞主要来源ATCC、DSMZ、ECACC、RIKEN、INCell、promocell、ScienCell、ECACC、JCRB、KCLB、Asterand、ICLC以及少数国外著名大学建系
细胞生长特性：贴壁或悬浮，详见细胞说明书部分
培养细胞的冻存及复苏：细胞低温冻存是培养室常规工作和通用技术。细胞冻存在-１９６℃液氮中，储存时间几乎是无限的。细胞冻存及复苏的原则是慢冻快融。【冻存细胞】１)选对数增生期细胞(证明无支原体污染)，在冻存前１d换液；２)按常规方法把培养细胞制备成悬液，计数，使细胞密度达５×１０／ml左右密度，离心，去上清；３)加入配制好的冻存液(培养液６.８ml，小牛血清２ml，DMSO １ml，５.６%NaHCO３ ０.１ml)，按与去上清相同的量一滴一滴加入离心管中，然后用吸管轻轻吹打令细胞重悬。冻存细胞时培养液中加入保护剂１０％二甲基亚砜(DMSO)或甘油，可使冰点降低，使细胞内水分在冻结前透出细胞外；４)分装于无菌冻存管中，每管加１.５m悬液；５)旋好冻存管并仔细检查，一定要盖紧，做好标记；６)冻存：在特殊的仪器或简易的液氮容器中，按-１℃／min的速度，在３０～４０min时间内，下降到液氮表面，再停３０min后，直接投入液氮中。要适当掌握下降冷冻速度，过快能影响细胞内水分透出，太慢则促进冰晶形成。操作时应戴防护眼镜和手套，以免液氮冻伤。【复苏细胞】１)从罐中取出冻存管；２)迅速放入３６℃～３７℃水浴，不时摇动，使其急速融化，３０～６０s内完成；３)冻存管用７０％酒精擦拭消毒后，打开盖子，用吸管将细胞悬液注入离心管中，再滴加１０ml培养液；４)低速离心(５００～１０００r／min) ５min，去上清后再用培养液洗一次；５)用培养液适当稀释后，装入培养瓶３７℃培养，次日更换一次培养液后，继续培养。以后仍按常规进行培养。冻存细胞数量要充分，密度应达到１０／ml，在融后稀释２０倍时，仍能保持５×１０／ml数量。
绝大部分细胞消化的时候是只要用胰酶润洗一遍即可。吸去胰酶后，残留的那些无法计算体积的附着在细胞表面的微量胰酶在37℃一般不到2min足够消化细胞。对于这些细胞原则上不要用胰酶孵育细胞，连续这样传代，对细胞伤害很大。简单的程序是PBS润洗吸去，胰酶润洗吸去，然后37℃消化。比较难消化的细胞（润洗方法5min还不能消化），这样的细胞一般需要用少量胰酶孵育。不是细胞全部成间隔分布很离散的单个圆形才算消化好了，一般你肉眼观察贴壁细胞层，只要能移动了，多半呈沙壮移动，其实已经可以了，很多人喜欢把细胞消化或者吹打成完全分离细胞，这是没有必要的。一般能移动了，说明细胞与培养基质材料的附着已经消失了，细胞之间的附着也已经消失了，细胞已经独立分布了（虽然没有呈现很广的离散分布）。这个时候应该停止消化，不要等到看到镜下所有细胞都分离得非常好，间隙很大，才停止。细胞就是完全成单个细胞悬液，之后在贴壁的过程中仍然会聚集，这个是贴壁培养的细胞，尤其是肿瘤细胞的一个特性。如果和标准形态不一致，那可能是自己没消化好导致的，但如果消化方法正确，仍然成片分布，甚至完全吹打成单细胞悬液，贴壁后仍然成片分布，这是细胞的特性，是因为贴壁过程中重新聚集了。这个时候你拼了命要去让它均匀分布，你的细胞之后会对你越来越不好。
因为细胞生长的时候肯定是要相互联系，大部分的细胞都是要成片生长的，尤其是对于贴壁细胞，单个细胞贴壁之后长着长着就长到一片去了。但是如果是成片的细胞抱团的话，传代后细胞是不能贴壁的，这样抱团的细胞就会死亡。所以，消化传代的时候一定要将细胞消化成单个单个的独立状态，这个啊是非常考究你的功夫的！细胞一旦脱落入悬液里你很难再将他吹打成单个，因为他没有受力点了。很难找到受力点让你对他吹打的力分散开细胞。所以必须要在细胞未脱落之前将其吹打开，受力点就是细胞贴壁的地方。这样你就必须要严格控制好消化的程度啊，这和大师做饭掌握好火候是一样的道理啊。既要消化到容易吹打下来，又不能太过，一吹就整片脱落，要单个单个地往下掉。所以我才要分批分次地加胰酶消化就是为了保证不同生长状态贴壁程度的细胞能够都维持在好的受力点分散开。这个是很重要的一点。尤其是对于某些细胞这一点就是他活去死的致命点。像Caco-２细胞就是如此。另外关于传代很重要一点就是一定不能等到细胞长满的时候才去消化传代。要在细胞长到７０%左右的时候就要传代了，一旦发现细胞生长中已经有叠层生长的时候就要立即进行消化传代。不能再拖了。关于换液传代时候洗瓶的问题。对于用DMEM培养基培养的细胞，你在洗的时候如果是用无血清１６４０去洗细胞在随即后的几次中会比用DMEM洗的长的要好。同样，用１６４０培养的也有这个现象。如果不嫌麻烦的话，可以用PBS来洗，洗的效果和用无血清培养基洗的效果基本上是一样的，对于有些细胞会更胜一筹。洗的目的主要是洗去培养瓶里残留的血清，防止它对胰酶的影响。这样能够保证胰酶的消化能力优先，是很关键的一点。先补充这么多，还会后续更新。再补充一点：传代时PBS洗是很重要的一步，最近发现，用PBS就可以把细胞消化开来。加入PBS放置１０-１５分钟，有些需要更长的时间，等到细胞一个个分离开来的时候，就可以直接吹打下来，但是和胰酶消化一样，要控制好时间，不能时间太过了，要不然损伤细胞，细胞不容易成活，状态容易不好。这个方法对于某些细胞是很管用的。有些细胞用胰酶消化不容易消化成单个的时候，或者临时没有胰酶了，可以选用此方法。不过一定要试试，看是否适合你的细胞。
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