上海宾穗生物科技有限公司

"NCI-H1404细胞：人乳头状腺癌细胞系
细胞背景资料：详见相关文献介绍
细胞形态：上皮细胞样
细胞生长：贴壁
细胞物种来源：人源或鼠源等其它物种来源
细胞产品包装：复苏形式：T２５培养瓶(一瓶)或冻存形式：１ml冻存管(两支)
细胞传代方法：１：２-１：３传代；每周换液２-３次。
细胞来源说明：细胞主要来源ATCC、DSMZ、ECACC、RIKEN、INCell、promocell、ScienCell、ECACC、JCRB、KCLB、Asterand、ICLC以及少数国外著名大学建系
细胞生长特性：贴壁或悬浮，详见细胞说明书部分
细胞培养方面注意的几点：无菌意识要强：实验进行前，超净台以紫外灯照射３０分钟灭菌，以７０%ethanol擦拭无菌操作抬面，并开启超净工作台风扇运转数分钟后，才开始实验操作。每次操作只处理一株细胞株，以避免失误混淆或细胞间污染。实验完毕后，将实验物品带出工作台，以７０%ethanol擦拭无菌操作抬面。无菌操作工作区域应保持清洁及宽敞，必要物品，例如支架、吸管等公用物品可以暂时放置，其它个人实验用品用完应立即拿出。实验用品以７０%乙醇擦拭后才带入无菌操作台内。实验操作应在中央无菌区域，一般勿在边缘区域操作。小心取用无菌之实验物品，避免造成污染。勿碰触吸管尖头部或是容器瓶口，亦不要在打开之容器正上方操作实验。容器打开后，以手夹住瓶盖并握住瓶身，倾斜约４５°角取用，尽量勿将瓶盖盖口朝上放置桌面。选择正确的培养基：不同的细胞可能培养基不同，甚至不同的文献可能对相同的细胞培养基成分也是可能不同的。如我当时培养神经干细胞，有文献就选用neurobase培养基，而我的实验目的主要是做抗氧化和氧化方面的，而这种培养基中含有抗氧化剂成分，此时，我就不得不选择另外一种不含抗氧化剂的培养基。瓶装血清一定要逐步解冻:４℃冰箱全溶后再分装，在溶解过程中须规则摇晃均匀(小心勿造成气泡)，使温度与成分均一，减少沉淀的发生。勿直接由–２０℃直接至３７℃解冻，因温度改变太大，容易造成蛋白质凝结而发生沉淀。热灭活是指５６℃，３０分钟加热已完全解冻之血清。水浴锅升到５６℃后，将血清放入，待温度升高到５６℃后计时，一般５分钟左右规则摇晃均匀一次。此热处理之目的是使血清中之补体成份去活化。除非必须，一般不要作此热处理，因为会造成沉淀物之显著增多，且会影响血清之品质。注意更换新血清(包括不同批次)对细胞的影响。
绝大部分细胞消化的时候是只要用胰酶润洗一遍即可。吸去胰酶后，残留的那些无法计算体积的附着在细胞表面的微量胰酶在37℃一般不到2min足够消化细胞。对于这些细胞原则上不要用胰酶孵育细胞，连续这样传代，对细胞伤害很大。简单的程序是PBS润洗吸去，胰酶润洗吸去，然后37℃消化。比较难消化的细胞（润洗方法5min还不能消化），这样的细胞一般需要用少量胰酶孵育。不是细胞全部成间隔分布很离散的单个圆形才算消化好了，一般你肉眼观察贴壁细胞层，只要能移动了，多半呈沙壮移动，其实已经可以了，很多人喜欢把细胞消化或者吹打成完全分离细胞，这是没有必要的。一般能移动了，说明细胞与培养基质材料的附着已经消失了，细胞之间的附着也已经消失了，细胞已经独立分布了（虽然没有呈现很广的离散分布）。这个时候应该停止消化，不要等到看到镜下所有细胞都分离得非常好，间隙很大，才停止。细胞就是完全成单个细胞悬液，之后在贴壁的过程中仍然会聚集，这个是贴壁培养的细胞，尤其是肿瘤细胞的一个特性。如果和标准形态不一致，那可能是自己没消化好导致的，但如果消化方法正确，仍然成片分布，甚至完全吹打成单细胞悬液，贴壁后仍然成片分布，这是细胞的特性，是因为贴壁过程中重新聚集了。这个时候你拼了命要去让它均匀分布，你的细胞之后会对你越来越不好。
细胞传代时消化的问题：可以这样说，对于需要消化传代的细胞，每一次的消化都是对这个细胞存活与否，状态好与不好最至关重要的考验。很多同学都遇到过这个问题，自己养的细胞开始的几代长的还挺好的，可是穿过几代之后就发现自己的细胞，状态越来越差劲了。对于这个问题，可以非常肯定地说，你的消化环节出问题了。你每一次的消化都让细胞受到较大损伤了。所以，越长越差。在消化的过程中，你加入胰酶后，所有细胞都在被胰酶消化着，但是我们忽视了一个问题就是，细胞的生长状态是不一样的，每一个细胞的贴壁情况也是不一样的，有的贴壁牢固，有的贴壁没有那么牢固的，所以，让所有的细胞消化同样的时间对细胞是不公平的，他们受到了差别待遇当然会有脾气啊。我后来对消化的方法进行了改良。争取做到因材施教呵呵。我称之为“四步消化法”。（以难消化细胞为例）；具体操作：１)首先不加胰酶，倒掉旧培养基加入少量新培养基洗１-２遍，（这是前奏，即为步，目的是将漂浮着的死细胞之类尽量洗掉。２)然后再加入少量新培养基直接吹打一遍，这一遍是把贴壁不牢固的细胞吹打下来。再用培养基洗一遍，两次所得悬液混合传入新瓶。即为第二步（你可以将这些传入新瓶培养，以与后面胰酶消化过的细胞对比观察看谁长的更好一点就知道该细胞对胰酶的敏感度了。）３)吸干净瓶内剩余液体，加入０.３ml左右的胰酶润洗一遍，吸掉弃之，再加入１ml左右的胰酶消化。消化的同时置于显微镜下观察，待细胞与细胞之间间隙明显的时候立即吸掉胰酶与干净子弹头里备用，加入新培养基开始吹打，吹打２-３遍后吸取悬液于试管或新瓶暂存。用２ml左右新培养基洗一遍与前面的混合。（你也可以传入新瓶培养，以与后面及前面的做对比。）这是第三步。４)然后把前面刚吸出来的胰酶重新加进去瓶里继续消化剩余的贴壁牢固的细胞。当然你也可以用新的胰酶，如果你们那比较富裕的话，呵呵。继续镜下观察，待剩余细胞间隙明显，细胞独立开来的时候，吸掉胰酶，加入新培养基吹打。悬液传入新瓶培养（根据实际情况你自己把握）。这是第四步。其实还可以有第五步，对于特别难消化的细胞和对胰酶特别敏感的细胞的话，你可以继续加第五步甚至第六步。为了细胞更好的状态，更漂亮的样子，没办法，你必须分多批多次消化，这样才能限度地将胰酶对细胞的损伤降到最低，保证细胞的状态能够。当然了，如果细胞是属于那种很容易消化的细胞，像RAW２６４.７，仅仅第二步就搞定了。就没必要第三步第四步了。这个是需要你在实验中能够自己用心去体会的。建议你接受一个新细胞时把各步消化的细胞分别培养起来做比较，去摸索好细胞对胰酶的要求。便于你后续实验的开展。将细胞消化分成这几步，除了是为了避免胰酶对细胞的损伤之外，还有一个更重要的作用就是，可以程度地把细胞吹打成单个单个的状态，不成片不连体。
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