免疫共沉淀Co-IP的实验优化

免疫共沉淀（Co-immunoprecipitation，Co-IP）是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的，用于研究蛋白质间相互作用的经典方法，是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。

当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质－蛋白质间的相互作用被保留了下来。如下图所示，如果用蛋白质A的抗体免疫沉淀A，那么与A在体内结合的蛋白质B也能沉淀下来。这种方法常用于测定两种目标蛋白质是否在体内结合；也可用于确定一种特定蛋白质的新的作用搭档。

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免疫共沉淀的操作方法本身较为简单，我们abs955 IP/CoIP试剂盒说明书对操作流程有完整说明，但为了获得更好的实验结果，相关的实验步骤需要根据实际情况进行优化。

1）裂解和洗涤缓冲液

裂解和洗涤缓冲液是维持复合物形成的关键因素。我们试剂盒配备的Lysis buffer使用优化的非变性裂解缓冲液，许多蛋白间的相互作用将保持完整。一般认为含有非离子型洗涤剂的低离子强度缓冲液（即<120mM NaCl）不太可能破坏蛋白间的相互作用。另外应避免在洗涤期间用超声或涡旋处理的方法裂解细胞、裂解物或珠子结合的免疫复合物，以防止破坏复合物间的相互作用。离心过程中应轻柔处理样品以确保减少复合物的损失。

2）固相支持物beads的选择

用于免疫共沉淀的固相支持物一般有琼脂糖珠和磁珠两种。琼脂糖珠由于其多孔表面、通常具有更高的结合能力，而磁珠在有条件的实验室操作相对更简便。我们的试剂盒配备优质Protein A/G 琼脂糖珠，有效性经开发试验充分验证。

3）非特异性作用的高背景

由于细胞裂解物中存在大量蛋白质，因此在操作过程中可能会发生与目标复合物的非特异性结合。这些非特异性相互作用一般通过彻底清洗珠子结合的免疫复合物来打破，但也可以应用其他策略来优化非特异性结合，例如：

(1)、通过将盐浓度从120mM滴定至1000mM来改变缓冲液的离子强度
(2)、减少一抗的使用量，直到信号干扰比化
(3)、参考我们推荐的操作步骤，进行细胞裂解物预清除（可选步骤）

4）抗体污染（IgG交叉反应）的优化

免疫共沉淀Co-IP中常遇到的问题是在WB分析中来自抗体IgG条带的干扰，IgG的轻重链在25kD和50kD左右，并且在SDS-PAGE中可能会有<5kD的偏移。针对这种情况可以采用以下几种方法进行优化：

(1)、IP和WB采用不同来源抗体，IP为鼠源则WB可以选用兔抗。
(2)、采用特异性识别IgG轻链或者重链的二抗，如目的蛋白与IgG轻链接近、则可采用重链二抗。
(3)、运用交联剂将IP抗体和Protein A/G -Beads交联，通过添加不含巯基乙醇的加样缓冲液处理目的蛋白-抗体- (4)、Protein A/G-beads复合物，最后离心去除复合物，上清中只留下目的蛋白。
(5)、将常用的融合标签掺入用于Co-IP主要靶蛋白中时，预固定的抗融合标签抗体可用于蛋白质复合物纯化。
WB分析前，可以考虑采用低pH洗脱来代替煮沸，低pH值（2-3）可以降低抗原/抗体相互作用、从而将抗原和抗体分离（如1M甘氨酸缓冲液，pH 2-3），注意电泳前需平衡pH。

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