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MTT技术服务 1、 MTT服务流程 ① 收集对数生长期细胞并计数; ② 接种细胞;配成单细胞悬液，接种于96孔板，接种密度为每孔103-104; ③ 培养细胞：5%CO2，37℃孵育，培养1天～5天(需根据试验目的和要求决定培养时间); ④ 加入MTT溶液，继续孵育4 h～6h; ⑤ 终止培养，去除培养上清液; ⑥ 加入DMSO，脱色摇床振荡10min，使结晶物充分融解; ⑦ 酶联免疫监测仪选择490nm或570nm波长，测定各孔光吸收值; ⑧ 记录结果，绘制细胞生长曲线。 2、 MTT原理 3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐{3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenylt- etrazolium bromide，MTT｝，商品名为噻唑蓝，是一种黄颜色的染料。MTT比色法是一种检测细胞存活和生长的方法，其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒(Formazan)并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜(DMSO)能溶解细胞中的甲瓒，用酶联免疫检测仪在490nm或570nm波长处，在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值。在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比，根据测得的吸光度值(OD值)来判断活细胞数量，OD值越大，细胞活性越强(如果是测药物毒性，则表示药物毒性越小)(图1)。该方法已广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等。 图1 MTT检测原理 3、 MTT应用 ① 细胞增殖程度的测定; ② 细胞活性的测定; ③ 药物或其他因素对培养细胞的毒性测定; 4、 MTT比色法原则 ① 设空白对照; ② 培养细胞的浓度应合适：通常情况下每孔103～104个; ③ 培养细胞的生长状态应合适; ④ 避免胎牛/小牛血清干扰：一般选小于10%的胎牛/小牛血清的培养细胞，显色后尽量清洗培养基; ⑤ 吸光度范围以0～0.7为宜，超出范围后不是线性关系被破坏; ⑥ 加入DMSO后应在在脱色摇床上振荡10～15min，然后测吸光值; ⑦ 每孔铺的细胞数目应均匀一致。 5、 MTT所需材料 ① MTT试剂： a: 0.5% MTT溶液(5mg/ml) b:胎牛血清或小牛血清; c: RPMI 1640培养基; d:DMSO; e:PBS缓冲液; f:胰蛋白酶消化液; ② MTT耗材： a:待检样本(培养细胞); b:96孔培养板; c:无菌的tip头; ③ 仪器： a:湿式CO2培养箱(图2); b:酶联免疫检测仪(图3); c:脱色摇床; d:台式离心机 图2湿式CO2培养箱 图3酶联免疫检测仪 6、 材料要求 ① 避免细胞污染; ② 呈色后尽量清除培养基，尤其是清除胎牛/小牛血清; ③ 实验材料涉及危险品，loogene公司不予服务; ④ 待检细胞尽量新鲜，待测细胞生长状态良好; ⑤ 提供尽量详细的实验背景材料。 7、 实验周期 ① 1-10个样本，7个工作日 ② 10-100个样本，10个工作日 ③ 100个样本以上，20个工作日 8、 提供结果 完整的实验操作步骤、吸光度值、细胞生长曲线(图1)、MTT统计分析(图4)等结果。 图4 MTT统计分析