武汉德晟生化科技有限公司

在生物化学及医学检验领域，准确测定碳酸氢根有利于了解人体的酸碱平衡状态、诊断相关疾病。而磷酸烯醇丙酮酸（PEP）法作为一种常用的测定碳酸氢根的方法，其涉及到一系列特定的实验试剂，每一种试剂都在整个检测流程中发挥着不可或缺的作用。 不过需要注意任何一种试剂的质量、使用方法以及操作规范都直接影响着最终的检测结果。

一、采血相关准备及注意事项 
为确保血样的准确性，对体检对象有着严格要求。首先需空腹 12 小时，减少食物代谢对血液成分的干扰，使检测结果更能反映人体的基础生理状态。同时，要求不饮酒 24 小时，酒精会影响肝脏代谢以及血液循环中的多种物质浓度，进而干扰碳酸氢根的测定。采血前，要求体检对象静坐 5 分钟，让身体适应采血环境，稳定心率、血压等生理指标，减少应激因素对血液成分的影响。

二、血液样本处理试剂与要求 
1、对于血液样本，抗凝剂管的选择是关键步骤。血浆样本可采用肝素（或 EDTA 二钾）管作抗凝剂。肝素通过增强抗凝血酶Ⅲ的活性，抑制凝血因子的活性，阻止血液凝固，它具有抗凝效果好、对血液成分影响相对较小的特点，能较好地保持血液中各种离子、酶等成分的活性。EDTA 二钾则通过与血液中的钙离子螯合，阻断凝血过程，适用于多种血液检测项目，能有效防止血液凝固，确保血浆样本在后续处理过程中的稳定性，为准确测定碳酸氢根提供保障。 
2、样本保存与处理时效：采集后的血清或血浆样本需室温放置 30 - 45 分钟后上机离心，这一放置时间是基于血液凝固过程所需。室温环境有利于血液自然凝固，使血细胞与血清或血浆充分分离。在 2 小时内必须完成检测，因为随着时间的延长，血液中的细胞成分会持续代谢，释放出各种物质，如乳酸、二氧化碳等，这些代谢产物会改变血液的酸碱平衡，影响碳酸氢根的测定结果。

三、关键缓冲剂、底物与酶制剂 
1、缓冲剂：实验可采用 pH = 6.5，25mmol/L 的 Tris 缓冲液，它在整个测定体系中起着维持稳定 pH 值的关键作用。碳酸氢根的测定对反应环境的酸碱度较为敏感，pH 值的微小波动都可能影响酶的活性以及化学反应的平衡。Tris 缓冲液具有良好的缓冲性能，在一定范围内能有效抵抗外界酸碱物质的干扰，确保反应体系始终处于适宜的 pH 条件下。 
2、底物：磷酸烯醇丙酮酸（PEP）浓度为 6.3mmol/L，它作为反应物参与到与碳酸氢根相关的化学反应中，是整个检测原理的核心物质之一。NADH（还原型辅酶Ⅰ，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸）浓度为 0.45mmol/L，在后续的酶促反应中，NADH 作为辅酶参与电子传递过程，其氧化还原状态的改变与碳酸氢根的浓度变化相关联，通过检测吸光度的变化来间接反映碳酸氢根的含量，为实验提供了可量化的检测指标。
3、酶制剂：磷酸烯醇丙酮酸羧化酶（PEPC）浓度为 200U/L，它催化 PEP 与碳酸氢根发生羧化反应，是整个测定过程中的关键酶，直接参与碳酸氢根的转化与检测反应。同时，镁离子试剂浓度为 8.0mmol/L，镁离子作为 PEPC 的激活剂，能增强酶的活性。苹果酸脱氢酶（MDH）至少 600U/L，它在后续的反应中参与辅酶的再生以及相关代谢产物的转化，维持反应体系的持续运转。

四、实验结果参考与试剂供应 
用 PEP 测定血清碳酸氢根具有一定的灵敏度指标可供参考，当二氧化碳浓度为 25mmol/L 时，吸光度为 1.3625 - 1.4750，这一数据为实验操作人员提供了判断检测准确性的依据。在实际检测中，通过比对样本的吸光度与该标准范围，可初步评估实验过程是否正常、试剂是否有效等。 

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