蛋白纯化前样品如何处理？这些注意点关系到实验成败

发布人：上海优宁维生物科技股份有限公司

发布日期:2024/12/27 15:15:35

在纯化实验开始前，样品处理常常是我们容易忽视的阶段。如果样品没有经过有效的预处理，样品中的不溶性杂质可能会影响我们实验的准确性，严重的还可能会堵柱子，影响柱子寿命！所以在纯化实验前，样品处理至关重要。

1、样品中主要含有哪些不溶性杂质？
由于复杂生物样品粗提取的限制，粗提液中一般都会含有不溶性悬浮物，例如生物膜片段、蛋白聚集体、未解离组织成分、细胞碎片、血清中的溶血凝集成分、腹水中的脂蛋白等等。在蛋白层析纯化前，需要对粗提样品进行预处理以去除不溶性悬浮物。

2、蛋白纯化前样品如何处理？
通过组合使用澄清过滤技术，可以有效地去除粗提取样品中的颗粒和大分子，从而获得更纯净的蛋白质样品，为后续的实验和分析提供基础。

离心和过滤是实验室中对粗提液进行澄清的常用方法，离心可以用于去除大多数颗粒物质。对于小体积蛋白样品，可以采用10000-15000 g离心15 min，然后再用针头滤器进行进一步过滤。如果样品体积较大，可以考虑使用切向流膜包或中空纤维柱进行过滤。

3、如何选择合适的滤器？
选择合适的滤器，一般需要考虑滤膜的孔径大小，滤膜材质以及膜有效过滤面积。

滤膜孔径的选择：
（1）如果我们的实验目的是需要我们的目标蛋白透过膜孔（滤过），应该选择膜孔径大小为目标蛋白直径5-10倍以上以降低过滤阻力，提高通透性。
（2）如果我们的实验目的是需要目标蛋白充分截留，则应选择膜孔径小于目标蛋白直径1/3-1/5，以尽可能减少蛋白损失。
（3）如果我们想用滤器去分离两个物质，理论上大小相差10倍以上的两种物质可以通过选择合适的膜孔径实现完全分离。

在纯化样品选择滤膜孔径时，我们可以参考以下的表格：

滤膜材质的选择：
滤膜材质的选择，要同时考虑到样品特性和溶剂的化学耐受性。蛋白样品推荐使用低蛋白吸附的滤膜，例如RC膜、PES膜、改良后的PVDF膜、CA膜。而NC和尼龙膜具有较高的蛋白吸附性，不推荐使用。

此外，滤膜的选择也要考虑膜材质和外壳材质的化学耐受性。特定化学溶剂可能会造成滤膜上纤维或颗粒的脱落，或产生溶出，从而影响过滤效果。

有效过滤面积（EFA）的选择：
有效过滤面积 (EFA, Effective Filtering Area) 是指可用于过滤样品的有效膜面积。

与澄清的流体相比，颗粒浓度较高的流体会更快地堵塞过滤器，选择有效过滤面积较大的滤器可以延长过滤器的使用寿命。然而也需要注意，滤膜的过滤面积越大，滞留体积也会增加，从而会引起样品的浪费。在处理成本高昂或异常珍贵的流体时，应尽量选择滞留体积低的滤器。一般来说，建议大家选择满足工艺要求的最小过滤面积的滤膜，既可以节约成本，也可以尽量降低吸附和滞留体积，从而提高回收率。也有一个小技巧可以给到大家，对于珍贵的样品，为了最大限度的回收样品，可以对滤器进行空气吹扫（air purge），即在样品过滤之后，使用注射器向滤器中打入空气，以收集更多的样品。

样品体积、有效过滤面积 (EFA) 与滞留体积之间的关系参考如下表：

多步过滤：
针对高颗粒含量的样品，普通的单层滤膜容易发生堵塞，此时可以考虑多步过滤。比如先用孔径在0.45 μm以上的滤器用来去除大的颗粒，再使用0.22 μm的滤器去除微量颗粒。

有些滤器含有预滤层，也适用于这个情况。常见的预滤膜介质，包括玻璃微纤维、聚丙烯等。例如Whatman GD/X针头滤器，内置玻璃微纤维滤纸-GMF150，GMF150是一种多层预滤膜介质，从上至下滤纸孔径依次减小，可以起到梯度过滤的效果，与没有加预滤介质的滤膜相比，过滤量高达3-7倍，相对于单层的预滤介质，拥有近2倍的过滤量。

4、什么是切向流过滤？
当样品体积较大（几百毫升甚至几升），针头滤器无法满足过滤体积和时间的需求或因频繁更换滤器造成成本较高时，可以采用切向流膜过滤进行样品的澄清过滤。

切向流过滤是指液体流动方向与透过方向垂直的过滤方式，与针头滤器等的死端过滤相比，切向流过滤中液体流动方向与膜平行，可以不停冲刷掉膜表面的堆积物，从而减少堵塞现象，保证处理速度，延长滤膜的使用时间。

切向流过滤过滤使用的介质主要有中空纤维和膜包两种，平板膜包的设计通过一张张平面的膜堆叠起来以增加过滤面积，液体样品在膜的表面流动；中空纤维柱通过一根根细长开口的纤维丝并联一起，增加过滤膜的面积。样品在开放的中空纤维丝中流动，由内向外透过。

膜包和中空纤维在应用上各有特点。用于细胞培养灌流、细胞澄清、菌体收集及菌体破碎液的澄清、病毒颗粒收集和纯化、胰岛素晶体的收集、脂质体及其它对剪切力敏感的样品处理时，中空纤维柱的使用比较普遍。开放流道同时也利于降低样品前行的阻力，从而也适用于高固含量及粘度较高的样品。此外，中空纤维柱可以高压灭菌，在线蒸汽灭菌 (SIP) 以及预灭菌产品，满足无菌工艺需求。

而如果样品对剪切力不敏感，膜包的筛网有助于提高传质效率，从而提高过滤通量和速度以及样品的浓度。所以在抗体、重组蛋白、疫苗及血液制品下游工艺中，膜包的应用非常普遍。

应用举例：切向流技术在中药样品制备中的应用
中药原自植物组织，含有大量的树脂、鞣质、蛋白、淀粉等大分子无效杂质，在最终制剂中必须去除。采用传统水、醇工艺需要反复转溶提取浓缩，步骤繁琐，生产周期长，有效成分含量损失，并且经过复杂步骤处理后，多数成品的杂质含量仍超过国家药典标准，澄明度和稳定性等问题仍未彻底解决。

切向流超滤技术可将溶液中的物质按分子量大小进行分离。中药及其复方的有效成分，如生物碱、黄酮类、苷类等分子量均较小（多在1000道尔顿以内），而无效成分（通常指蛋白、鞣质、树脂、淀粉等）的分子量较大，结构复杂，通过选择适宜截留分子量的超滤膜，可达到选择性地去除无效成分、保留有效成分的目的，增加中药制剂的安全性和稳定性。

其他常规应用
使用中空纤维进行澄清过滤，无须提前通过离心进行细胞或细胞碎片的去除，例如，大肠杆菌裂解液可不经过离心直接使用中空纤维进行澄清；而哺乳动物细胞或酵母分泌表达的的发酵液也可以直接进行澄清过滤，无须先进行细胞去除。一般来说，对于哺乳动物细胞分泌表达上清的澄清过滤，可选择0.2um到0.65um微滤膜；对于大肠杆菌裂解液的澄清过滤可选择500KD或750KD超滤膜；而酵母分泌上清的澄清过滤可使用750KD超滤膜或0.1um 微滤膜。具体选择可以参考下表：

5、超滤离心管和脱盐柱有什么用？
超滤离心管可以用于小量的样品浓缩，例如分子筛对上样量有限制，可以先使用超滤管对样品进行浓缩，然后再进行上样，可以提高分辨率以及节约时间。超滤离心管有PES，Hydrosart多种材质，以及3KD-1000KD多种截留分子量可以选择。更大体积可以使用Vivacell超滤浓缩杯，可一次处理100ml样品。

脱盐柱可以用于对样品进行脱盐和缓冲液置换，离子交换之前需要降低缓冲液中的盐浓度，建议先使用脱盐柱对样品进行脱盐处理，置换到起始缓冲液中。

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