3D肿瘤球&类器官药敏活性检测攻略

概述
近年来使用3D肿瘤球&肿瘤类器官模型在大型化合物库中的高通量药物筛选、检测单药或多药浓度等方面，展现出能够帮助研究者快速筛选出药物敏感性强、反应性好、效果优的癌症适应症药物的能力。在2D细胞药敏活性检测中，CCK8法应用广泛，然而在3D肿瘤球&肿瘤药物敏感活性中，ATP荧光法比CCK8法检测更准确，今天小爱带大家了解检测攻略。 

ATP生物发光技术原理
本试剂盒采用生物发光(bioluminescent)法，利用 Firefly luciferase(萤火虫荧光素酶)催化底物—荧光素的转化，高效利用ATP的能量，发射出光子。发光信号与存在的 ATP 量呈正比，而ATP与存在于类器官中的细胞数目直接呈正比，有效检测3D肿瘤球&类器官活性。
  

本试剂盒为多孔板而设计，是进行自动化高通量筛选(HTS) ，3D肿瘤球&类器官增殖和毒性分析的理想选择。均质检测步骤就是将单一试剂直接加入含有类器官培养基的孔板中，无需去除基质胶。
均质检测的"加样-混合-检测" 的操作方案使得3D肿瘤球&类器官裂解和产生的发光信号与存在的ATP量成正比，而ATP量直接与类器官中的细胞数量成正比。独特的均质检测方案避免了那些需要多个步骤的ATP检测方法可能会引入的误差。 

产品组成

注意：产品建议现配现用

产品特点 
（1）简化了类器官活性检测步骤：均质的"加样-混合-检测"方案减少了其它同类检测所需的操作步骤。 
（2）类器官用量更少：可准确地检测到低于常用的比色法和荧光法的检测低限的细胞数。 减少了每个检测反应所需的细胞数。 
（3）迅速获得结果：加入试剂后 10 分钟就能获得数据。
（4）可自行选择检测方案：可用于多种类型的多孔板操作。可用发光检测仪或CCD成像设备记录数据。 
（5）可连续处理培养板：发光信号稳定，样品可进行批量处理。

使用方法
1、 类器官的准备： 
使用适合进行化学发光检测的96 孔板（ 底和盖子透明，孔壁不透，推荐货号： abs7242），每孔接种5ul-10ul类器官基质胶混悬物，放培养箱半小时以上，待凝固后加入100ul类器官培养基（如使用384孔板，每孔接种2.5μl-4μl类器官基质胶混悬物，具体用量视不同类型的384孔板而定），并确保检测时每孔的细胞数量在5万个以内（如使用384孔板宜控制在1万个以内），同时设置不含类器官的基质胶培养液孔作为阴性对照，按照类器官培养的常规方法培养类器官。如有需要，可加入药物处理类器官。此外，如有必要，也可以设置类器官的浓度梯度，以便后续确定试剂盒的使用效果。
2、 试剂准备： 
1管冻干粉加入1管10ml buffer里，混匀避光待用。 
注：溶解后尽快使用，-80℃，避光保存，有效期一个月。 
（1）溶解 Organoid ATP 发光法检测试剂，如有必要可适当分装该试剂。 
（2）按照96孔板每孔100μl (384孔板每孔25μl)  的量，取适量Organoid ATP 发光法检测试剂，平衡至室温。
3、类器官活力检测： 
（1）取出类器官培养板在室温平衡10分钟(通常不宜超过30分钟)。 
（2）将96孔板每孔里的类器官培养基去除，每孔加入100μl Organoid ATP 发光法检测试剂(384孔板每孔25μl)。 注：无需去除基质胶。 
（3）室温剧烈振荡（微孔板恒温振荡器，推荐货号：abs72034 ）5分钟使类器官充分裂解。  
（4）室温(约25℃)孵育10分钟，使发光信号趋于稳定。 
（5）使用具有检测化学发光功能的多功能酶标仪进行化学发光检测。请根据仪器要求设置 相应的参数，每个孔的检测时间一般为0.25- 1秒或更长时间，具体需根据仪器的检测灵敏度进行适当的调整。 
（6）根据化学发光读数直接计算类器官的相对活力，或根据ATP标准曲线计算出ATP的量从而计算出类器官的相对活力。
注：检测效果因类器官的种类不同而有所不同，对于一些ATP含量特别高的类器官，在细胞数量达到50,000个后可能会不呈线性相关，但化学发光读数还是会继续升高。

常见问题
1、荧光素酶的活性对温度比较敏感，所以反应前类器官和检测试剂均需平衡至室温后再进 行测定。检测试剂请混匀后使用。
2、本试剂盒的检测试剂中含有荧光素酶，反复冻融会导致其逐渐失活。为取得良好的使用效果，第一次溶解后可适当分装保存，但需注意分装的容器不能有ATP污染。 
3、待测药物的溶剂含量较高时可能会干扰荧光素酶反应，从而影响化学发光信号。可以通过设置含有溶剂的类器官培养液对照孔排除溶剂的干扰。 
4、检测时须使用适合于类器官培养的白色或黑色的96孔板或384孔板。如果使用普通透明的96孔板或384孔板，相邻孔之间会产生相互干扰。 
5、类器官接种密度，以24传96孔板为例
传代前状态：24孔板，每孔25ul基质胶类器官凝聚物，500ul培养液
传代比例：类器官1:2传代
接种方式：24孔板传96孔板
96孔接种要求：每孔5ul基质胶类器官凝聚物，100ul培养液
接种孔数：24孔板收集3孔类器官传代，按1：2传代比例要传6孔，每孔点胶25ul，总点胶量6*25=150ul，此时传于96孔板，每孔点胶量5ul，总点孔数150/5=30孔

ICC（胆管癌）类器官96孔铺板密度图

检测案例

类器官药敏-人肝胆管癌（ ICC ）

结论：人肝胆管癌（ ICC ）类器官对Oxaliplatin、Lenvatinib、Larotrectinib、Regorafenib不敏感；对Cisplatin、Paclitaxel敏感

类器官药敏-人肺癌
 

结论：人肺癌类器官对drug1一般敏感； 对drug2敏感

类器官药敏-人胰腺癌
 

结论：人胰腺癌类器官对Irinotecan、Oxaliplatin一般敏感； 对Paclitaxel、Gemcitabine敏感；两个病人表现出的药敏效果一致。
类器官药敏-人胰腺癌
 

结论：人胰腺癌类器官对Larotrectinib、Oclacitinib、Lenvatinib、5-Fluorouracil不敏感一般敏感； 两个病人表现出的药敏效果一致。

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