小优进修班∣Navinci部分产品效果解读

发布人：上海优宁维生物科技股份有限公司

发布日期:2024/12/18 16:42:04

上期讲到：Naveni® PLA技术&现有文献部分解析，本期为大家带来Navinci部分产品效果解读，更全面的了解Navinci产品信息，便于您更精准的挑选适合的试剂盒。

肿瘤免疫研究方向
题目1：In situ detection of various activated immune checkpoints via next-generation proximity ligation assays in tumor tissue

Introduction
免疫检查点（IC），如 PD1/PD-L1 轴，是下调 T 细胞免疫反应的抑制性信号通路。它们在维持外周组织的免疫耐受方面发挥着至关重要的作用。除了抗原递呈细胞和其他免疫细胞外，许多肿瘤也表达 PD-L1，这使它们能够躲避免疫系统。因此，IC 抑制在癌症治疗领域掀起了一场革命。然而，其有效性仅限于定义不清的一部分患者。高水平的 PD1/PD-L1 相互作用以及通路激活的其他标志（如 PD1 磷酸化和 SHP-2 招募）可能比单独一种 IC 蛋白的过表达更能预测患者的预后。因此，需要更好地了解 IC 蛋白与免疫系统之间复杂的相互作用，以改善癌症治疗效果。

Technology and methods
为NaveniBright™ kit（明视场读数）和NaveniFlex™ Tissue kit（荧光读数）开发了优化的PLA方法。为使目标相互作用可视化，将 FFPE 组织（Biomax）与相关目标的特异性单克隆抗体对孵育，然后与 Navenibodies（与专有寡臂连接的亲和试剂）孵育。只要Navenibodies足够接近，就会产生强烈而独特的信号，从而产生滚圆放大反应。该信号可使用显色剂或荧光进行检测，并分别通过明视野或荧光显微镜进行评估。在明视野中与其他标记物共同染色时，将针对细胞角蛋白的 HRP 标记抗体与 Naveni™ PD1/PD-L1 AP 结合使用。对于荧光共染，在检测步骤中加入不同的荧光标记抗体（如泛细胞角蛋白、CD8a、CD20 和 CD3d），并通过外荧光显微镜评估信号。

图1：Naveni® PLA技术工作流程示意图

Results
要激活 T 细胞，需要将其 T 细胞受体 (TCR) 引入抗原。然而，启动不仅会诱导免疫反应，还会启动抑制程序，而 PD1 与其配体 PD-L1 的结合会促进抑制程序的启动。PD1 细胞质尾部的磷酸化是其发挥抑制功能的必要条件，从而导致磷酸酶 SHP-2 的招募。我们创建了一种基于近距离接合的超灵敏检测的免疫分析系列（PLA分析），以提高组织染色的预测价值并观察肿瘤微环境：

图 1-2. 使用 Naveni™ PD1/PD-L1 检测 PD1/PD-L1 相互作用。直接观察鳞状细胞癌（肺，AP 读数，图 1）或扁桃体（HRP 读数，图 2）中 PD1 和 PD-L1 之间的相互作用。

图 3. 扁桃体中使用 Naveni™ PD1/PD-L1 AP 和细胞角蛋白-HRP 共染的 PD1/PD-L1 相互作用+细胞角蛋白。

图 4. 使用 Naveni™ pY PD1 HRP 在扁桃体中检测 PD1 磷酸化。检测 PD1/PD-L1 抑制通路激活的第一步。

图 5. 使用带有 PD1 和 SHP-2 一抗的 NaveniBright™ AP 试剂盒检测淋巴结中的 PD1/SHP-2 相互作用（右颈弥漫性 T 细胞淋巴瘤）。

图 6-7. PD1/PD-L1 免疫图谱分析：Navinci开发了基于 NaveniFlex™ 组织试剂盒的多重检测方法，用于检测 PD1/PD-L1 相互作用，以及相关生物标记物的荧光读数共染色。结论：在治疗前确定 IC 抑制剂的应答者至关重要，但目前的诊断方法（如 PD-L1 IHC）在确定受益患者方面的准确性有限。为此，开发了多种用于免疫分析的试剂盒和检测方法，可以检测 PD1/PD-L1 免疫检查点轴上的关键相互作用，以及可视化肿瘤微环境的各种相关生物标记物。活化的 IC 和肿瘤浸润淋巴细胞或肿瘤标志物的可视化有助于推动癌症研究的前沿发展，并为深入了解 IC 抑制疗法的机制提供了可能性。

图 6. 非小细胞肺癌 TMA 中的 PD1/PD-L1 相互作用以及细胞角蛋白和 CD8 染色。通过细胞角蛋白成本染色（绿色）、丰富的 PD1/PD-L1 相互作用（洋红色）和浸润的 CD8 T 细胞（铁锈红色）可观察到肿瘤细胞。(A）组织概览。白色方框显示放大区域。(B-D）放大显示标记物的不同组合，以便于观察。箭头表示细胞角蛋白阳性细胞和 CD8 阳性细胞之间的 PD1/PD-L1 相互作用，表明肿瘤细胞正在诱导 T 细胞抑制。

图 7. 霍奇金淋巴瘤中的 PD1/PD-L1 相互作用及 CD3 delta 和 CD20 共染（混合细胞，收获部位淋巴结，10% 癌细胞）。大的多核细胞通过 PD1/PD-L1（红色）与 T 细胞（CD3 delta，黄色）相互作用。绿色为 CD20 阳性的 B 细胞。

Conclusion
在治疗前确定对 IC （Immune checkpoints）抑制的应答者至关重要，但目前的诊断方法（如 PD-L1 IHC）在确定受益患者方面的准确性有限。为此，我们开发了多种用于免疫分析的试剂盒和检测方法，可以检测 PD1/PD-L1 免疫检查点轴上的关键相互作用，以及可视化肿瘤微环境的各种相关生物标记物。活化的 IC 和肿瘤浸润淋巴细胞或肿瘤标志物的可视化有助于推动癌症研究的前沿发展，并为深入了解 IC 抑制疗法的机制提供了可能性。

题目2：Multiplexed proximity ligation-based method uncovers immune checkpoint activation in the context of the tumor microenvironment

Background
免疫检查点（IC），如 PD-1/PD-L1 轴，是下调 T 细胞免疫反应的抑制性信号通路，在维持外周组织的免疫耐受方面发挥着至关重要的作用。癌细胞可以操纵 IC 通路来逃避免疫监视，从而使其成为绝佳的免疫疗法靶点。然而，由于患者群体界定不清，这些疗法的成功一直受到阻碍。通过将 PD-1/PD-L1 相互作用与相关生物标记物（如 CD20、CD3d、CD8a 和细胞角蛋白）的可视化结合起来，就有可能建立一个信息丰富的免疫图谱，从而提高免疫疗法成功的可能性。利用 Navinci 的高灵敏度和特异性原位邻近连接技术（Naveni® PLA技术），结合额外的生物标记染色，可以发现霍奇金淋巴瘤、头颈部鳞状细胞癌（HNSCC）和非小细胞肺癌（NSCLC）的肿瘤微环境（TME）。PD1/PDL1相互作用与免疫荧光中PD-L1染色的比较也表明，PD-L1的存在并不等同于相互作用的存在。

Technology and methods
针对 Naveni PD1/PD-L1 Atto647N 试剂盒（荧光读数）开发了一种优化的原位近接方法，用于检测 PD-1/PD-L1 蛋白-蛋白相互作用。为了使目标相互作用可视化，将霍奇金淋巴瘤、头颈部癌和 NSCLC（Discovery Life Sciences，TissueArray）的 FFPE 组织与 PD-1 和 PD-L1 特异性单克隆抗体孵育，然后与 Navenibodies（与专有寡臂连接的亲和试剂）孵育。只有当 Navenibodies 靠近到足以产生滚动圈扩增反应时，才会产生强烈而明显的信号。为了观察相关的生物标记物，如泛角蛋白、CD8a、CD20 和 CD3d，在检测步骤中加入了荧光标记抗体，并通过外荧光显微镜评估信号。（同图注：Naveni® PLA技术工作流程示意图）

图 2：四种不同样本（A. 霍奇金淋巴瘤；B. & D. NSCLC；C: HNSCC）进行了Navinci PD1/PD-L1 Atto647N 检测，并对另外两种标记物进行了联合染色。还使用免疫荧光评估了 PDL1 的表达（第 5 行）。所有图像中的细胞核均为蓝色。

图 3：为了更好地观察复杂的 TME，Naveni PD1/PD-L1 Atto647N 可与针对相关生物标记物的荧光团结合的一抗复用。

Results
使用 Naveni PD1/PD-L1 Atto647N 试剂盒结合多重免疫荧光抗体对霍奇金淋巴瘤、头颈部鳞状细胞癌 (HNSCC) 和非小细胞肺癌 (NSCLC) 这三种癌症类型进行了评估（图 3）。霍奇金淋巴瘤的特征是存在ReedSternberg细胞，这是一种大的异常B细胞（CD20）。霍奇金淋巴瘤组织用其他生物标记物 CD20 和 CD3d 染色（图 2 A1-4），显示出复杂的 TME。PD-1/PD-L1 相互作用的染色模式表明癌细胞集群，CD3d 阳性 T 细胞在这些部位周围的共定位也清晰可见。PD-L1 的免疫荧光染色（图 2 A5）与 PD1/PD-L1 相互作用的定位一致。
抗PD1/PD-L1疗法是某些NSCLC病例的一线治疗策略，因此PD-L1的表达作为一种预测性生物标志物已被广泛研究。使用纳维尼 PD1/PD-L1 检测法评估了两例 NSCLC 是否存在相互作用，并对细胞角蛋白和 CD8a 进行了共染（图 2 B1-4 和 D1-4）。还进行了免疫荧光以评估 PD-L1 的表达（图 2 B5 和 D5）。与样本 D 相比，样本 B 的 PD-L1 表达量更高，PD1/PD-L1 相互作用的水平也更高。最重要的是，可以观察到细胞毒性 T 细胞（CD8a 阳性）在肿瘤区域（细胞角蛋白阳性）的浸润，并且相互作用集中在两种细胞类型的交叉点周围，这表明可能存在免疫逃避。
复发性或转移性 HNSCC 可采用抗 PD1/PD-L1 免疫疗法治疗，但反应率有限。与 NSCLC 相似，PD-L1 的表达也被用作患者分层的预测标志物。虽然整个组织切片的 PD-L1 表达一致（图 C5），但相互作用的发生率要低得多。在细胞角蛋白阳性细胞中几乎检测不到相互作用，也没有观察到 CD8a 阳性细胞。

Conclusions
研究发现，霍奇金淋巴瘤细胞表达 PD-L1 与预后不良和耐药性有关。然而，PD-L1 和 CD3 在 TME 中的共表达可能预示着更有利的预后和对免疫疗法更好的反应。同样，NSCLC 肿瘤中 CD8 阳性 T 细胞的存在也与临床预后的改善有关，这可能是由于它们具有识别和杀死癌细胞的能力。PD-L1 表达通常用于确定 HNSCC 的治疗策略，但对 IC 治疗的反应仍然较低，这表明仅用 PD-L1 作为预测性生物标志物是不够的。比较 IF 和Navinci PD1/PD-L1 Atto 647N 的结果表明，PDL1 的表达并不总是表明存在 PD1/PD-L1 相互作用。利用 Navinci 技术，可以将邻近连接技术与共标记物染色复用，使复杂的 TME 可视化，从而改善患者分层，最终实现适当的治疗。

NaveniFlex Tissue产品实验效果
题目：Powerful background reduction in fluorescent tissue stains with an improved proximity-based technology for detection of protein-protein interactions

Introduction
通过原位近接试验对组织进行免疫荧光染色是一种成熟的工具，可用于高灵敏度地检测蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）、翻译后修饰（PTM）及其定位。标准的免疫荧光（IF）和原位近接检测法会受到本底信号的影响，本底信号来自荧光标记检测试剂与某些类型细胞的非特异性结合（细胞特异性本底）。因此，很难区分真正的生物相关信号和背景信号。为了解决这个问题，我们开发了 NaveniFlex Tissue，这是一种基于近距离连接的方法，针对组织使用进行了高度优化。与之前可用的技术相比，它可以产生和显示被背景遮挡的信号，从而大大提高了检测灵敏度。（同图注：Naveni® PLA技术工作流程示意图）

图 1. NaveniFlex Tissue 与商用原位近接试剂盒 X 检测人乳腺癌 FFPE 组织中 Podocalyxin/Ezrin 的能力比较。试剂盒 X 在 Podocalyxin/Ezrin 阳性染色和技术阴性对照中都产生了相似的染色模式。两幅图像中的高背景掩盖了任何特定的相互作用信号。相比之下，NaveniFlex Tissue 能清晰显示阳性染色中的相互作用（离散的红色斑点），而技术性阴性对照则没有。

图 2. NaveniFlex Tissue 与商用原位近接试剂盒 X 检测健康人肾脏 FFPE 组织肾小球中 Podocalyxin/Ezrin 的能力比较。使用 NaveniFlex Tissue 与试剂盒 X 相比，特异性提高，背景降低。

图 3. 卵巢癌 TMA 中低丰度和高丰度核芯中的粘蛋白/间皮素相互作用。间皮素与粘蛋白-16的结合有助于卵巢癌向腹膜转移，而腹膜转移是恶性进展的标志。因此，这种相互作用的存在可能对确定患者的无复发生存期具有预后意义。NaveniFlex Tissue 能成功染色稀疏（1 级鳞癌）和高度丰富（透明细胞癌）的相互作用（见放大图）。

图 4. 使用 NaveniFlex 组织在人类 FFPE 扁桃体中检测到的 PD1/PD-L1 相互作用。PD1/PD-L1 相互作用（红色）在免疫肿瘤学中具有重要意义，但用旧的近距离连接方法很难检测到。然而，NaveniFlex Tissue 却能检测到这种对预后非常重要的相互作用。绿色为 IF 细胞角蛋白共染色。

Conclusion
NaveniFlex Tissue 能特异、灵敏地荧光检测 FFPE 和固定冷冻组织中的 PPIs 和 PTMs。它通过有效降低细胞特异性背景，超越了传统的基于近距离的方法。这改善了各种健康和病变组织中信号和信噪比的可视化。

Naveni TriFlex Cell实验效果
题目：Naveni TriFlex Cell: An emerging method for simultaneous detection of free proteins and their interactions

Introduction
蛋白质与蛋白质之间的相互作用（PPIs）对细胞功能和生物过程的发挥至关重要。通过同时可视化不参与相互作用的蛋白质池，PPI 鉴定这项本已极具挑战性的任务又向前迈进了一步。在两种蛋白质结合或未结合时对它们进行快照，为研究它们的功能状态以及在刺激/抑制、细胞分裂、蛋白质降解等情况下的相互作用打开了大门。

同时检测和定量总β-catenin 和 E-cadherin，以及它们之间的相互作用。
E-cadherin（洋红色，"蛋白 A"）和 β-catenin（黄色，"蛋白 B"）定位于细胞膜和细胞质中。E-cadherin/β-catenin 复合物（茶色，"相互作用 AB"）通过参与粘连接头的形成，在组织纤维化、癌症进展和维持上皮完整性方面发挥重要作用。在每次检测中，所有试剂盒成分均使用不同的一抗组合，以显示检测的特异性。MR Abs = 两种一抗（阳性染色）。仅 M Ab = 仅 E-cadherin（技术对照）。仅 R Ab = 仅 β-catenin（技术对照）。放大 40 倍。

荧光信号的共存并非蛋白质相互作用的同义词

COX1（黄色）是线粒体标记物，与高尔基体标记物 GM130（品红色）没有相互作用。这两种蛋白定位于不同的细胞区室，但在信号特别密集的区域，它们会出现部分共定位（白色）（见合并）。然而，TriFlex 能正确检测到它们之间没有相互作用（没有茶色信号，见 Cy5 通道的分割图像）。由于在检测相互作用时存在近距离限制，TriFlex 可实现比宽视野显微镜中常规共染色更高的分辨率。放大 40 倍。

Conclusion
Naveni TriFlex Cell 是第一种基于近距离的技术，它不仅能检测蛋白质的相互作用，还能提供每个相互作用伙伴的定量信息，无论是单独的还是作为相互作用的一部分。在不同条件下，可以观察和测量蛋白质状态的微妙变化（结合与未结合），同时保留其亚细胞定位的空间信息。

PD-1/PD-L1在肿瘤中的相互作用
题目：Automation of Proximity Ligation Immunoassay for interaction between PD-L1 and PD-1 detection in the tumor microenvironment using microfluidic-based systems

Introduction
我们开发了 NaveniFlex™ Tissue近接技术的自动化版本，这是一种成熟的方法，能以高度特异性检测蛋白质-蛋白质相互作用和翻译后修饰 (PTM)。与手工方法相比，近接技术的自动化为蛋白质相互作用和 PTM 的标准化、可重现的多重分析提供了新的可能性，并大大减少了操作时间。我们与 SciLifeLab 的空间蛋白质组学国家实验室和 Lunaphore 合作，优化了 NaveniFlex™ Tissue近接技术，使其与 Lunaphore 的 LabSat® 和 COMET™ 自动染色平台兼容。这些平台可结合 RNA 检测进行连续多重免疫组化 (IHC) 和连续免疫荧光 (seqIF™) 染色，以研究组织中的空间生物学。ß-catenin/E-cadherin和PD-1/PD-L1之间的相互作用证明了接近连接技术的实用性。ß-catenin/E-cadherin之间的相互作用对维持上皮细胞的完整性非常重要。这些蛋白的异常表达可导致转移，并与多种恶性肿瘤有关。PD-1和PD-L1之间的相互作用对癌细胞逃避免疫系统非常重要。PD-1 和 PD-L1 蛋白在细胞和组织中的大部分功能都是通过发生修饰和形成动态复合物来实现的，而基因组学、转录组学或传统的免疫染色方法都无法探究这些效应。目前正在开发的许多癌症疗法都会影响 PD-1/PD-L1 信号转导，因此研究 PD-1/PD-L1 轴的工具至关重要。

方法
整个 NaveniFlex™ Tissue 方案是在 LabSat® 仪器上对 FFPE 组织切片全自动运行的，然后在 COMET™ 仪器上进行 seqIF™ 染色。NaveniFlex™ Tissue方案与任何一抗都兼容。在本研究中，以下试剂成对使用：小鼠抗 E-Cadherin 和兔抗ß-Catenin；小鼠抗 PD-1 和兔抗 PD-L1。当该方案与 COMET™ 上的 seqIF™ 结合使用时，近距离检测的一抗被洗脱，随后用一抗孵育同一组织切片，进行 CD3、CD4 和 CD8 的免疫荧光染色。自动化工作流程如图 1 所示。

1. 两种一抗结合其目标表位
2. 与寡核苷酸结合的纳文抗体与一抗结合
3. DNA 寡核苷酸杂交，连接间隙，形成环状 DNA 模板 4.
4. 通过滚圆扩增（RCA）扩增环状 DNA 模板 5.
5. 荧光标记的 DNA 寡核苷酸与扩增的 RCA 产物杂交。
抗原回收和 1 至 5 的所有原位 PLA 步骤均在 LabSat® (b) 上自动完成 6.
6. 用普通荧光显微镜或 COMET™ 仪器的内置显微镜观察荧光团标记的 RCA 产物 (c)
7. 通过洗脱去除 RCA 产物
8. 新的一抗与目标表位结合，然后是荧光团标记的二抗
9. 利用 COMET™ 仪器的集成显微镜对免疫荧光染色进行成像 10.
10. 洗脱一抗和二抗复合物
11. 步骤 8 至 10 可重复进行，在 COMET™ 上每次自动运行可检测 40 个标记物。
*滚动循环扩增（RCA）是一种基于环状DNA模板的恒温核酸扩增技术。

NaveniFlexTM Tissue on LabSat® vs manual

图 2. 用 FarRed 荧光团（黄色）检测到粘膜中 ß-catenin/E-cadherin 相互作用的原位 PLA 信号的正常结直肠组织切片。(a) 在 LabSat® 上运行的原位PLA（NaveniFlex™ Tissue）。 (b) 人工生成的原位PLA信号。底图为阴性对照，即排除一抗，在 LabSat® 上进行（c）或手动进行（d）。上图（a-b）显示，LabSat®和人工原位PLA检测的PLA原位染色效果相当。图像使用 20x (0.75 NA) 物镜的外荧光显微镜采集。

Colon tissue microarray run on LabSat®

图 3. 上图（a）为结肠 TMA，用 FarRed 荧光团（黄色）检测到ß-catenin/E-cadherin 相互作用产生的原位 PLA 信号。上排组织核心为腺癌，中排为粘液腺癌，下排为与癌症相邻的正常结肠组织。腺癌（b）和与癌症相邻的正常结肠组织（c）的放大视图。使用 20x (0.75 NA) 物镜的外荧光显微镜采集图像。

扁桃体生殖中心的 PD-1/PD-L1 蛋白相互作用

图 4. 扁桃体组织切片在 LabSat® 自动染色平台上用 NaveniFlexTM Tissue技术和 IF 染色。从左至右：（a）阴性对照（排除一抗），扁桃体组织的生发中心未染色。(b）原位PLA信号（红色），显示 PD-1 和 PD-L1 蛋白之间的接近性。(c）原位 PLA 信号放大至一个生发中心。(d-e）图片显示的是同一生发中心在 LabSat® 上进行的 PD-L1（黄色）和 PD-1（绿色）的 IF 染色。图像用 20x (0.75 NA) 物镜采集。

在 COMET 上自动将 NaveniFlex 组织与 seqIF 结合使用

图 5：（a）在 LabSat® 自动染色平台上用 NaveniFlexTM Tissue技术染色的霍奇金淋巴瘤患者淋巴组织切片，以 FarRed（红色）检测 PD-1 和 PD-L1 的相互作用。(b）放大的组织切片。(c) 与 (b) 相同的放大图，在 COMET™ 仪器上对 CD3（紫色）、CD4（绿色）和 CD8（黄色）进行 seqIF™ 染色，在同一组织切片上进行原位 PLA 后运行。所有图像均使用 COMET™ 仪器和 20 倍物镜采集。

Conclusion
我们已经证明，我们的技术 NaveniFlex™ Tissue 可以在 LabSat® 上实现全自动操作，结果与人工操作相当。我们的数据证明了从近距离检测中洗脱抗体和检测试剂，并在 COMET™ 上使用同一样本进行后续 seqIF™ 染色的可行性。该方法非常灵活，用户可以自由选择任何一抗，既可用于蛋白质-蛋白质相互作用，也可通过顺序免疫荧光进行单个蛋白质检测。近接技术的自动化为蛋白质相互作用和 PTM 的标准化、可重现的多重分析提供了新的可能性，只需最少的动手时间。从组织制备到装片的 PLA 手工操作方案通常需要两天时间。我们相信，这种方法将能对肿瘤和免疫系统之间的界面进行空间和功能研究，并提供有关信号通路原位激活的必要信息，后者代表了组织诊断领域的最新技术水平。

文中使用好物

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货号

名称

介绍

NaveniFlex系列

NT.MR.100.Red

NaveniFlex Tissue MR Red

用于组织样本，根据一抗来源（M：鼠；R：兔）种属选择试剂搭配使用，一款试剂兼容两种一抗，包含TEX615、Atto647N荧光团检测

NC.MR.100.Atto647N

NaveniFlex Tissue MR Atto647N