上海阿拉丁生化科技股份有限公司

蛋白质去磷酸化实验方案

        蛋白质去磷酸化是细胞内一个重要的生化过程，涉及从蛋白质上的特定氨基酸残基上去除磷酸基团。该过程与蛋白质磷酸化相对应，两者共同形成对细胞信号转导至关重要的动态平衡。蛋白质磷酸化和去磷酸化作为一对可逆的生化反应，通过“分子开关”的方式，精细调控蛋白质的结构、功能以及细胞内的多种生理活动。

        蛋白质去磷酸化的主要功能是由一类称为蛋白质磷酸酶的酶类催化完成的，这些酶能够水解磷酸酯键，即丝氨酸、苏氨酸以及酪氨酸位点的去磷酸化。这一过程对于调节蛋白质的活性、稳定性、亚细胞定位以及与其他分子的相互作用至关重要。

        蛋白质去磷酸化的紊乱与多种疾病的发生发展密切相关，包括糖尿病、肥胖、肿瘤、神经退行性疾病以及自身免疫性疾病等，因此蛋白质磷酸酶也成为了潜在的药物发现靶标。在生物医学研究和药物开发中，理解和调控蛋白质去磷酸化过程对于揭示疾病机制和开发治疗策略具有重要意义。

        为了证明抗体对磷酸化状态的蛋白质的特异性，可以在SDS-PAGE之前或转移到膜之后对蛋白质进行去磷酸化。与未处理的样品相比，去磷酸化的样品应几乎不染色或不染色。

所需材料

        - 小牛肠碱性磷酸酶（CIP）

        - CIP缓冲液：100 mM NaCl、50 mM Tris-HCl、10 mM MgCl2、1 mM二硫苏糖醇，25ºC时pH值调节至7.9

        - 蛋白酶抑制剂混合物，不含EDTA

实验步骤

• SDS-PAGE之前对裂解物进行去磷酸化

1.先用裂解缓冲液中裂解细胞或均质化组织，然后测定蛋白质浓度，留出两份裂解物/均质化组织样本。一份用于去磷酸化，一条用于对照（未处理的样品）。

        注意：一般建议每条泳道的粗提取物含有20-30 µg的蛋白质。

        避免在裂解缓冲液中使用正钒酸钠（RIPA 裂解缓冲液的一种成分）和 EDTA：10 mM正钒酸钠可抑制CIP（10单位）90%的活性，而50 mM EDTA可使CIP活性（10单位）几乎100%失活。

        如果使用粗提取物，则必须在CIP缓冲液中加入蛋白酶抑制剂。

2.将蛋白质/裂解物重悬于CIP缓冲液中，每1 µL 1× 缓冲液含1 µg蛋白质，含蛋白酶抑制剂，不含EDTA。

3.向“+磷酸酶”处理的样品中添加CIP酶，每µg蛋白质添加1单位CIP。在37°C下最多孵育60分钟，如果担心蛋白水解降解，可以适当缩短孵育时间，或者放到较低温度下进行孵育。

4.此时可以将样品冷冻并保存，或按照SDS-PAGE的常规方式进行后续操作。

        注意：如果有需要的话，可以添加磷酸钠（pH 7.4）作为竞争性抑制剂，最终浓度为10 mM。

• 转膜后的去磷酸化

        对于仅在蛋白质变性时结合其磷酸化蛋白靶标的抗体，转膜后用磷酸酶处理膜可能比在SDS-PAGE前用磷酸酶处理未变性的裂解物更好。为了进行良好的控制比较，用磷酸酶处理的膜应该是从包含一个或多个重复泳道的单个凝胶印迹中切下的一块。

实验步骤

1.将凝胶蛋白转移到硝酸纤维素或PVDF上，并用含有0.1% Triton X-100和5% BSA的TBS溶液在室温下封闭膜1小时。

        注意，这里不建议用牛奶替代BSA，牛奶中含有酪蛋白，一种磷酸化蛋白，如果抗体与磷酸化位点发生交叉反应，则可能产生背景染色。

2.在转膜完成后，使用标记笔或刀片在膜上划线，确保每个样本和其重复样本都被包含在不同的膜片段中。

3.然后沿着划线切割膜，使得每个片段都至少包含一个样本及其对应的重复样本。一个片段上可用于进行去磷酸化处理，而另一个片段可用于常规检测，从而比较处理前后的差异。

4 .将两片分别放入装有CIP缓冲液的容器中，每个容器3-5 mL。

5.往溶液中添加CIP，进行去磷酸化处理。

如需了解更多产品详情，请前往阿拉丁官网查询。

https://www.aladdin-e.com