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    荧光分子成像技术作为近来被予以高度关注的生物成像技术，具有无放射性暴露及高时空分辨率的优点。其中，近红外荧光成像技术组织穿透力强、伤害低、成像清晰度高且自发荧光弱，在保持高时空分辨率的同时可以实现实时动态成像，为无创诊断提供了一个高度通用的潜在的平台。出于对组织穿透深度和分辨率进一步的追求，发射波长处于短波红外区域的荧光分子染料成为更优选。

    常见的短波红外小分子骨架包括供体-受体-供体染料 (D-A-D)、花菁类染料、BODIPY染料。为了优化短波红外分子库、改善分子性能，北京师范大学周凯翔副教授（点击查看介绍）课题组对半花菁染料（D-π-A结构）展开研究。通过分子工程策略，该课题组设计合成了一类新的半菁染料SRHCYs，成功通过调控分子结构实现了分子的激发与发射光谱由近红外一区区域到短波红外区域的跨越，建立了分子光学性质和结构的关系，提出了分子探针合成的新策略，展示出长波下清晰的生物成像。相关成果发表在Journal of Medicinal Chemistry 上。

图1. SRHCYs的合成设计思路

    受近红外一区半花菁染料合成办法的启发，该课题组采用类似策略，选取已被报道的分子FD-1080中苯并[c, d]碘化吲哚盐为电子受体，取连有强供电子基团——二甲氨基——的系列醛为电子供体。不同长度的聚甲基键连接以上二者，使整个分子形成有效的、共轭程度不同的电子推拉结构（图1）。

    图2. (a) SRHCYs的合成路线. (b) SRHCYs在CH2Cl2 (10 μm) 中的吸收和荧光发射光谱. (c) 优化了SRHCYs的基态(S0)几何形状、最高占据分子轨道和最低未占据分子轨道。(d) SRHCYs的荧光图。

系列化合物的光学性质通过逐增的π共轭体系调控。测试发现分子的吸收和发射光谱展现出有规律的、明显的100 nm左右的红移，且从SRHCY-3开始跨入短波红外区域（图2b）。通过计算化学模拟也可以发现SRHCYs系列化合物HOMO-LUMO能隙实现了有效降低（图2c）。这展现出半花菁类染料在波长红移方面的优势。进一步将SRHCY-4与部分花菁类染料对比（如Flav7、相同数目双键的FD-1080），发现半菁染料具有更长的发射波长。这说明设计半菁结构对分子的光学性质确有优化之实。以上的对比及系列化合物的性质表征展现出D-π-A结构化合物的发展潜力，更体现出增强供体强度和延伸聚甲基链两大合成策略的优越性，为自由调控分子探针的吸收和发射波长提供了基本方法。

    综合探针在发射波长和荧光强度两方面性能的考量，该课题组选择SRHCY-3在不同医学应用场景下进行效果测试。通过点击化学将功能基团PEG链连接在化合物上，以提高探针的生物相容性和水溶性实现高质量成像。随后分别对小鼠的全身血流、肿瘤新生血管、淋巴、肿瘤等进行成像。

图3. 静脉注射SRHCY-3-PEG2000后，Balb/c裸鼠全身血管的背部 (a)、侧面 (b) 和腹部 (c) 实时成像。曝光时间为5 s时的背视图、13 s时的腹侧视图及8 s时的侧视图上的蓝色虚线的荧光强度剖面图的位置和方向，分别对应d、e、f所示的荧光强度分布图。

    该课题组主要使用SRHCY-3-PEG2000对小鼠作全身血流成像（图3），为血管结构的精确可视化及探索血管功能障碍开辟了新的可能性。由于肿瘤的生长和转移密切依赖于新血管的生成，团队把SRHCY-3-PEG2000制作成胶束溶液以监测肿瘤生成的微观血管的细节（图4）。可以看到肿瘤的主血管及其分支首先被识别，然后观察到致密的毛细血管，而大血管的荧光信号减弱至消失。该清晰过程表明纳米尺度的SRHCY-3-PEG2000胶束在短波红外下检测时可以为微观细节提供高对比度。

图4. (a) 使用SRHCY-3-PEG2000胶束对a549荷瘤小鼠肿瘤新生血管的代表性时间节点图像。

(b, c) 分别在5和102 s获得的图像中所标记的白色虚线上的荧光强度分布图。

     考虑到淋巴系统在癌症转移时的重要性，团队首先使用SRHCY-3-PEG2000对淋巴成像（图5a），可以清晰显示仰卧位小鼠的淋巴血管和淋巴结。然而由于SRHCY-3-PEG2000在前哨淋巴结引流肿瘤过程中成像效果不佳，故使用SRHCY-3-PEG5000，并与上市销售的的荧光染料ICG对比成像效果（图5d、e）。可以看到ICG荧光虽强但肝脏及肠道的摄取高，降低了成像的分辨率，且全程无肿瘤摄取。而SRHCY-3-PEG5000既达到了对淋巴成像的高信噪比，又实现了肿瘤的高摄取，成像效果更加优越。

    图5. (a) 将SRHCY-3-PEG2000 (~ 10 μL, 5 mM) 注射到正常Balb/c裸鼠的后脚垫，暴露时间为500 ms，对其进行背侧短波红外荧光成像。注射后不同时间点的左/右腘窝淋巴结和左/右骶骨淋巴结清晰可见。(b) 腹侧a549的肿瘤小鼠体内淋巴结/血管定位的短波红外成像。右侧为淋巴管红色虚线附近的强度分布图。(c) 淋巴结浸润性肿瘤的荧光注射及成像方法。(d, e) SRHCY-3-PEG5000 (d) 和ICG (e) 在不同时间点 (1200 nm LP，曝光时间= 500 ms) 的体内短波红外淋巴灌注成像。红色箭头表示淋巴结位置。(f) d、e部分标记的高斯点扩散函数沿红色虚线的截面强度分布图。

    精确的肿瘤成像是癌症诊断和治疗干预的关键。通过测试，该课题组发现PEG链的增长可以提高肿瘤的摄取。于是使用SRHCY-3-PEG5000分别对U87脑胶质瘤和原位A549肺癌小鼠进行成像实验。由图6a观察得到，从注射后24 h开始，U87肿瘤变得清晰可见且其对比度在30 h时达峰值而后衰减。通过离体生物分布数据可以观察到肿瘤相较于其他器官的高摄取。这展现了SRHCY-3-PEG5000短波红外成像的高组织穿透深度和优信噪比。图6e成功通过分子探针成像验证了A549原位肺癌恶性肿瘤的存在，证实了SRHCYs短波红外成像肿瘤的有效性。

    图6. SRHCY-3-PEG5000在体内短波红外肿瘤成像。皮下注射SRHCY-3-PEG5000 后裸鼠U87胶质瘤脑瘤的代表性时程图像(a) 

    和瘤肉比 (b)。96 h时对小鼠作离体生物分布数据分析 (c) 显示肿瘤摄取高于其他器官。(d) 原位U87胶质母细胞瘤脑瘤小鼠可检测到强烈的肿瘤荧光。裸鼠的CT图像显示了植入的U87脑瘤的大小和位置。(e) 原位a549的裸鼠肺癌定位活检的体内短波红外成像。从肿瘤小鼠和正常对照小鼠肺剥离后的离体正面和侧面图像证实了存在恶性肿瘤。

    最后，基于SRHCY1-4最佳发射波长之间具有明显差异（红移）的优势，该课题组进行了多色成像实验（图7）。研究得出该系列分子可以实时监测身体不同部位的状况，相互分离且互不干涉，进一步拓展了该探针的科研及医用价值。

图7. SRHCY-1-PEG2000（100 μM）、SRHCY-2-PEG2000（10 μM）和SRHCY-4胶束（10 μM）的双色和三色成像

    北京师范大学文理学院（珠海校区）学生郭珈铭、朱毅玲为该论文的共同第一作者，北京师范大学自然科学高等研究院（珠海校区）副教授周凯翔为论文唯一通讯作者。该研究得到了国家自然科学基金青年项目以及北京市自然科学基金面上项目支持。

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