蛋白酶K(Proteinase K)在这几年间走入大众视野，但在此之前的不少研究实验中，它已然是十分重要的存在。蛋白酶K，属于丝氨酸蛋白酶类，具有极高的酶活性和广泛的底物特异性。

在原位杂交技术中通常用于杂交前的样品处理，它具有消化包围靶DNA蛋白质的作用，能增加探针与靶核酸结合的机会，提高杂交信号。在DNA提取中，主要作用是酶解与核酸结合的组蛋白，使DNA游离在溶液中，随后用不同方法进行抽提，除去杂质，收集DNA。

图  蛋白酶K关键催化位点

蛋白酶K应用率较高，虽说其稳定性也很高，但在实际应用中，总会发现蛋白酶K不能带来很好的功效，如何用好蛋白酶K，希望本篇文章能够帮到正在实验中遇到问题的小伙伴们。

【Q&A】

Q1：蛋白酶K的适配pH范围是多少？

A: 蛋白酶K在较广的pH范围内均有活性，金普诺安推荐pH范围为7.5-11.5。

Q2：蛋白酶K合适温度推荐是多少？

A: 推荐温度范围是37-70℃，70℃时活性处于顶峰。

Q3：干粉蛋白酶K如何配制？

A: 将蛋白酶K固体溶解于稀释缓冲液[20mM Tris-HCl（pH 7.4），1mM CaCl₂，2%甘油]中，配制成20-40mg/ml溶液，在消化液或裂解液中添加蛋白酶K至终浓度为50-200μg/ml；蛋白酶K溶液若需反复使用，需分装保存，避免反复冻融。

Q4：蛋白酶K的储存条件？

A: 冻干粉可于4℃以下干燥环境中储存有效期3年；液体有效期1年，打开包装使用后，如果在2～8ºC环境下放置超过1周时间，建议过滤除菌，防止微生物污染。

Q5：干粉溶解后保存需要特殊的保护剂吗？

A: 溶解于稀释/储存缓冲液后，不再需要特殊的保护剂。

Q6：若实验样本为复杂样本，想要提取核酸，需要用蛋白酶K处理吗？

A: 推荐使用，如痰液、粪便类样本，可能存在可抑制PCR反应的物质（糖蛋白、免疫球蛋白等），及残留较多RNA酶。使用蛋白酶K可大程度灭活RNA酶，防止病毒RNA的降解，提高RNA回收率。

Q7：能否说下蛋白酶K的浓度对实验的影响？

A: 蛋白酶K在原位杂交技术中通常用于杂交前的处理，但若浓度过高、消化时间过长或孵育温度过高时，会对细胞的结构有一定的破坏，导致组织切片的脱落，细胞核的消失，从而影响杂交结果。

而在DNA提取中，若蛋白酶K浓度过低，就会影响蛋白质的水解程度，导致提出的DNA含量和纯度都会受到影响。

Q8：蛋白酶K的抑制剂和激活剂有哪些？

A: 抑制剂：二异丙基氟磷酸（DIFP），苯甲基磺酰氟（PMSF）；

    激活剂：1-5mM Ca ²⁺；

Ca²⁺可以保护蛋白酶K不会自我降解、增加蛋白酶K的热稳定性、调节蛋白酶K的底物结合位点；对于难处理、需长期处理的样本（如运用于病毒保存液中时），因为处理时间较长，对蛋白酶K的钙离子依赖性有较大改进需求。

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结语：蛋白酶K应用广泛，包括且不仅限于皮革、毛皮、丝绸、医药、食品、酿造等方面。以上为大家介绍的就是蛋白酶K在使用过程中的注意要点，在实验过程中与其接触会造成皮肤过敏反应，为了安全和健康考虑，使用时需务必穿好实验服，佩戴好防护手套和护目镜等进行操作。