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    循环性缺氧已被认为是多种肝脏疾病的典型特征，其实时成像对于更好地了解其生物学功能具有重要意义。例如肝脏缺血再灌注(HIR)是肝脏外科手术如肝脏移植、肝部分切除等过程中经常遇到的生理现象，肝缺血是通过动脉夹夹住小鼠的肝动脉和门静脉以导致约 70％的肝脏血流被剥夺，从而导致肝脏为乏氧状态，再灌注过程是将钳夹从血管上释放出来以恢复血液供应，从而导致肝脏为复氧状态。近年来，文献报道了多例用于诊断肝脏乏氧的敏感型荧光探针，并进一步将荧光成像与光声成像相结合，以高灵敏度和高组织穿透深度的特点可视化细胞和组织的形态结构。然而，大多数乏氧探针是不可逆的，换言之，探针一旦响应乏氧环境将始终保持荧光“开启”状态，不再实时地监测氧气压力(pO2)变化，这不可避免地导致“假阳性”信号。因此，目前尚缺乏有效的光学探针用于肝脏循环乏氧的可逆性检测。

图1. 探针AzoCy-CF3可逆性检测“乏氧-常氧”的反应机制及在肝脏缺血再灌注和非酒精性脂肪肝模型中的应用 (图片来源：CCS Chemistry)

    近期，南京大学郭子建院士/陈韵聪教授团队开发了一例新颖的近红外乏氧可逆探针AzoCy-CF3，如图1所示，它由荧光报告单元硫杂蒽部花菁和乏氧识别基团双三氟甲基芳环偶氮组成。该探针由于偶氮键的快速异构化而淬灭荧光，在乏氧状态下，偶氮键还原为肼键并伴随吸收波长红移，760 nm 处荧光增强96.3倍。AzoCy-CF3探针在体外溶液和细胞中都表现出“乏氧-复氧”环境下的循环可逆成像，且在肝正常L02和肝癌 HepG2 细胞乏氧状态下表现出较高的氧含量敏感性，并成功应用于荷HepG2小鼠肿瘤的乏氧监测。进一步将探针AzoCy-CF3应用于肝脏缺血再灌注(HIR)模型中，实时“可逆性”跟踪 HIR 过程，即在缺血时近红外荧光/光声(NIRF/PA)信号增强，再灌注时NIRF/PA信号减弱，如此循环往复。此外，该探针成功可视化了非酒精性脂肪肝(NAFLD)模型中慢性肝脏乏氧的程度，并在体内评估了各种保肝药物对NAFLD的治疗效果。这种高效的NIRF/PA可逆型探针为建立一个专门用于诊断和监测乏氧相关性肝脏疾病的平台提供了一个强大而可靠的成像工具。相关研究成果发表在CCS Chemistry (DOI: 10.31635/ccschem.024.202404092）。

急性/慢性肝损伤的乏氧可逆双模式成像

    如图2所示，AzoCyS-CF3本身吸收峰在625 nm附近，乏氧处理后吸收峰红移至725 nm，达到光声成像窗口。AzoCyS-CF3初始态由于偶氮键作用而荧光淬灭，乏氧处理后其760 nm 处的荧光显著增强；随后将该测试液放置于常氧空气中，发现其荧光又发生了淬灭，再补加小鼠肝微粒体(内含偶氮还原酶)和NADPH (还原性辅酶)后，荧光重新打开；如此数次循环后探针实现了“常氧-乏氧-常氧”条件下荧光“关-开-关”的可逆响应，光声信号也实现了类似的变化。AzoCyS-CF3的可逆行为是因为探针的偶氮键被还原后停留在第一步的苯肼结构，而两个吸电子基三氟甲基可以稳定苯肼状态，使其不会继续被还原，在氧气存在时，苯肼将电子传递给氧气，自身被氧化成初始态偶氮键。同时，荧光强度-时间曲线图表明该响应平衡时间为20分钟且增强幅度达到 96.3 倍，相比之前的工作在光谱响应性能上有很大的进步。

图2. 探针AzoCyS-CF3可逆响应“乏氧-复氧”环境的NIRF/PA光谱图 (图片来源：CCS Chemistry)

    据文献报道，肿瘤组织是常见的乏氧环境，其原因是肿瘤细胞快速地生长，消耗氧气和其他养分，而内部血管的生长速度相对较慢，导致血流量减少，供氧能力大大削弱，使得局部肿瘤组织形成乏氧区域。如图3所示，在活体肿瘤模型中研究了探针AzoCyS-CF3在体内的乏氧识别性能。荧光成像显示左侧皮下注射组荧光略有增强，而右侧瘤内注射组荧光在1 h内大幅度增强至3.7倍，且从小鼠全身图中也能看出荧光信号强弱的明显差异。这表明 AzoCyS-CF3可以在肿瘤部位乏氧环境特异性激活。进一步采集左侧皮下和右侧肿瘤的 730 nm处光声信号，由图可见，肿瘤中光声信号显著增强，而皮下注射组的信号几乎没有明显变化，通过 3D 重建获得三维组织图像，再将三维图沿 X 轴进行分割，得到一系列的组织深度成像图。可以看出在健康的皮下组织中，随着组织深度的变化，PA730 光声信号几乎没有变化，说明正常组织没有乏氧的特征。相比之下，肿瘤中的光声信号强烈且主要集中在内部，肿瘤边缘的信号较弱，说明实体瘤中氧含量分布高度不均匀，其内部由于血管供氧速度远低于肿瘤生长速度而导致严重乏氧。以上方法和结果表明 AzoCyS-CF3可以精确区分肿瘤乏氧异质化，为可视化测定乏氧程度和辅助癌症治疗提供有力的分子工具。

图3. 探针AzoCyS-CF3用于肿瘤乏氧荧光/光声双模式成像 (图片来源：CCS Chemistry)

    肝脏缺血再灌注(HIR)是肝脏外科手术过程中经常遇到的生理现象，该行为会产生高度的氧化应激和典型的急性肝损伤，同时这种缺血-供血过程无法避免地导致肝脏经受循环乏氧-复氧历程。探针AzoCyS-CF3具有肝脏代谢和保留的能力，选取在尾静脉注射探针2 h后进行HIR 手术并跟踪成像(λex: 740 nm，λem: 790 nm±20 nm)，且整个过程在三个小时内完成，这样可避免由代谢和浓度引起的荧光变化。如图4所示，尾静脉注射 AzoCyS-CF3后 2 h，立即手术缺血，以注射后2 h为零点，荧光强度在前20分钟迅速增强至2.5倍，并在接下来的20 分钟内保持不变；40分钟后去掉动脉夹，恢复血液供应，此时荧光强度迅速降低，20分钟后降低至最低值并几乎变化。以注射后2 h为零点，整个荧光变化过程可以总结为：增强(缺血开始，前 20 min)-平台(20 min~40 min)-降低(灌注开始，40 min~60 min)-平台(60 min~80 min)，光声信号亦达到了类似的响应。因此，探针AzoCyS-CF3能实时跟踪HIR手术中乏氧-复氧过程，且响应时间为20分钟，具有手术导航的潜在作用。

图4. 探针AzoCyS-CF3用于肝脏缺血再灌注模型中荧光/光声双模式成像 (图片来源：CCS Chemistry)

    非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是目前全球最常见的慢性肝病，可从肝脏脂肪变性发展到肝硬化。在高脂饮食(HFD)的小鼠中，慢性缺氧已被确定与NAFLD的发病机制有关，然而，目前很少有研究通过监测体内乏氧程度来评估保肝药物的疗效。如图5所示，根据不同的结构类型筛选了6种保肝药物，即奥贝胆酸(OCA)，奥利司他(ollistat)，己酮可可碱(PTX)，N-乙酰半胱氨酸(NAC)，硫辛酸(α-LA)和S-腺苷甲硫氨酸(SAM)，用以研究探针在 NAFLD小鼠模型的乏氧程度双模式成像来评估其疗效。按照标准程序，用HFD喂养小鼠8周，建立 NAFLD 动物模型。随后将小鼠随机分为正常对照组(NC)、HFD组(HFD组)和康复组(分别给予6种药物饮食)。通过尾静脉给小鼠注射AzoCys-CF3，并进行时间依赖性荧光成像，研究发现，对于HFD小鼠组，肝脏区的荧光信号比NC组强约2.6倍，而康复组表现出比HFD 组更弱的荧光信号。显然，SAM组和OLST组的肝荧光下降较为明显，分别比HFD组低42%和54%。从不同小鼠组获得的主要解剖器官的荧光图像与体内荧光图像一致。光声信号的变化趋势与荧光成像结果一致。并且可通过血清生化标志物如谷丙转氨酶(ALT)，天冬氨酸氨基转移酶(AST)，γ-谷氨酰胺酰基转移酶(γ-GGT)和肝脏H&E染色组织病理学检查来评估肝损伤程度，这些生化指标检测结果与利用乏氧水平作为生物标志物的体内 NIRF/PA 成像的表现非常一致。这些结果证实 AzoCys-CF3可作为一种有效的NIRF/PA双重成像试剂，用于监测慢性肝缺氧和评估保肝药物对NAFLD的治疗效果。

图5. 探针AzoCyS-CF3用于NAFLD小鼠慢性缺氧模型的体内检测及药物保肝作用的评价 (图片来源：CCS Chemistry)

    该工作提供了一例可靠的双模式成像试剂AzoCyS-CF3，用以可视化肝脏循环缺氧历程和慢性肝疾病康复评估，这对研究循环乏氧相关性疾病的病理进展具有重要意义。

相关研究成果发表在CCS Chemistry (DOI: 10.31635/ccschem.024.202404092），南京大学博士后姚善昆为第一作者，郭子建教授、陈韵聪教授为通讯作者。详见：Shankun Yao, Zelong Wu, Yuming Zhang, Tao Yang, Hao Yuan, Weizhong Ding, Weijiang He, and Zijian Guo* & Yuncong Chen*. Dual mode reversible imaging of the hypoxia status of acute and chronic hepatic injury. DOI: 10.31635/ccschem.024.202404092.

转载链接：南京大学郭子建/陈韵聪教授团队：急性/慢性肝损伤的乏氧可逆双模式成像 (qq.com)

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