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BrdU染色方案

 

  

       BrdU（溴脱氧尿苷或5-溴-2'-脱氧尿苷）是胸腺核苷的类似物，在BrdU染色实验中用于识别增殖细胞。

 

       BrdU可在体外对细胞系和原代细胞培养物进行标记，也可在体内对活体动物的细胞进行标记。在BrdU检测过程中，BrdU被掺入复制的DNA中，可使用抗BrdU抗体进行检测。

 

       EdU染色是一种替代方法，其流程比BrdU染色更短、更简单。

 

 

阶段1   BrdU标记

 

       BrdU标记可在体外和体内进行。有几种方法可用于体内标记细胞，包括腹膜内注射和口服给药。

 

•  体外用BrdU标记细胞

 

所需材料

 

       -BrdU抗体（如Ab179916）

       -可选：BrdU对照载玻片作为BrdU组织掺入的阳性对照

 

实验步骤

 

1.将3 mg BrdU溶解于1 mL水中，制备10 mM BrdU储备溶液。

 

2.用细胞培养基稀释10 mM BrdU储备溶液，得到10 µM BrdU标记溶液。

 

3.在无菌条件下，将10 µM BrdU标记溶液通过0.2 µm过滤器过滤。

 

4.除去细胞中现有的培养基并替换为10 µM标记溶液。

 

5.将细胞置于BrdU标记溶液中，在37ºC的CO2培养箱中孵育1 - 24小时。

 

       • 提示： BrdU孵育时间取决于细胞分裂的速度。原代细胞可能需要长达24小时，而快速增殖的细胞系可能只需要1小时。应优化达到最佳信噪比所需的确切时间。

 

6.从细胞中除去BrdU标记溶液，并用PBS清洗两次，每次清洗约5秒钟。

 

7.再用PBS清洗三次，每次两分钟。

 

8.根据标准免疫细胞化学（ICC）方案固定和透化细胞。

 

       • 在进行免疫染色之前，请参阅下面的DNA水解步骤。

 

•  通过腹膜内注射进行体内BrdU标记

 

所需材料

 

       - 用PBS配置的10 mg/mL BrdU溶液

       - BrdU抗体（如Ab179916）

       -可选：BrdU对照载玻片作为 BrdU组织掺入的阳性对照

 

实验步骤

 

1.将BrdU稀释于PBS中，制成10 mg/mL的无菌溶液。

 

2.对于小鼠，一般来说，注射浓度为100 mg/kg的BrdU溶液。

 

       • 提示：注射后30分钟即可检测到BrdU进入快速分裂的组织（如小肠）。但是，对于大多数组织，您可能需要等待长达24小时。确切的治疗时间和剂量需要根据您感兴趣的组织进行优化。

 

3.用BrdU处理后，可按照实验室批准的程序处死动物。

 

4.根据标准免疫组织化学（IHC）方案固定和处理组织。

 

       • 继续免疫染色之前，请参阅下面的DNA水解步骤。

 

•  通过口服给药进行体内BrdU标记

 

       口服 BrdU是一种非侵入性方法，因此可用于延长BrdU给药时间，不过由于无法控制动物的饮水量，它可能会给实验带来变化。

 

所需材料

 

       - BrdU储备溶液（例如10 mg/mL）

       - BrdU抗体（如Ab179916）

       -可选：BrdU对照载玻片作为BrdU组织掺入的阳性对照

 

实验步骤

 

1.用饮用水将 BrdU稀释至0.8 mg/mL。

 

       • 注意：每天准备新鲜的并更换。

 

       • 提示：对于小鼠，每天225 mg/kg BrdU（通过测量每只动物的饮水量计算）应可达到足够的BrdU标记。但是，确切剂量应根据个别实验条件进行优化。

 

2.用BrdU处理后，即可根据标准方案处死动物。

 

3.根据标准IHC实验方案固定和处理组织。

 

       • 然而，在免疫染色之前，请参考下面的DNA水解步骤。

 

 

第 2 阶段   DNA水解

 

       BrdU标记后，可能需要在固定和通透后进行额外的DNA水解步骤（有时称为 DNA变性步骤），以允许抗BrdU抗体接触DNA内的BrdU。

 

       一些研究报告表示，也可进行热诱导表位修复来代替HCl水解步骤，然后继续免疫染色。

 

•  细胞

 

所需材料

 

      -硼酸钠缓冲液：

             - 3.8 g硼酸钠（MW=381.4）+ 100 mL蒸馏水

             -用NaOH调节pH值

      - 1-2.5 M 盐酸

 

实验步骤

 

1.室温下将细胞放入 1 - 2.5 M HCl 中孵育10分钟至1小时。

 

       • 注意：应根据您的实验优化准确的 HCl 浓度和孵育时间。

       如果使用更短的孵育时间，37℃孵育可能比室温孵育更有效。

 

2.可选步骤：除去HCl，并在室温下用 0.1 M 硼酸钠缓冲液（pH 8.5）中和30分钟。

 

3.用PBS清洗三次。

 

4.根据标准免疫细胞化学（ICC）方案继续进行免疫染色。

 

•  组织切片

 

       • 注意：如果使用石蜡包埋切片，请确保在继续操作之前将其脱蜡。

 

所需材料

 

       -硼酸钠缓冲液：

              - 3.8 g硼酸钠（MW=381.4）+ 100毫升蒸馏水

              -用NaOH调节pH值

       - 1-2 M盐酸

 

实验步骤

 

1.将组织切片放入1-2 M HCl中孵育30分钟至1小时。

 

       • 注意：应根据您的实验优化准确的 HCl 浓度和孵育时间。

如果使用更短的孵育时间，在37℃下孵育可能比在室温下更有效。

 

2.可选步骤：中和组织切片。

 

       • 室温下将切片放入0.1 M硼酸钠缓冲液（pH 8.5）中孵育10分钟。

 

3.用PBS清洗三次，每次清洗约5秒钟。

 

4.按照标准IHC方案继续进行免疫染色。

 

 

第 3 阶段   与抗BrdU共染色（可选）

 

       BrdU抗体可与细胞类型标记物（例如Ki67、doublecortin和 NeuN）一起使用，以识别增殖细胞和新分化的神经元。

 

•  Ki67

 

      Ki67 蛋白是细胞增殖的标志物，存在于周期 G1、S、G2 和 M 期的细胞中，但不存在于静息（G0）细胞中。Ki67 抗体可代替或与BrdU结合使用来标记增殖神经元。

 

•  双皮质素

 

     未成熟神经元表达的微管相关磷蛋白。双皮质素抗体可与BrdU结合使用，以识别未成熟的有丝分裂后神经元。

 

•  神经氨酸酶

 

       NeuN是成熟神经元的标记物，可与BrdU染色结合使用来识别新分化的神经元。

 

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