浅谈药物杂质标准品定量研究方法之定量核磁

在杂质的研究中，除了对杂质做定性研究之外，很多时候也需要做定量方面的研究，从而能比较准确地了解杂质的真实含量，和高效液相数据的匹配度如何，为进一步把控药物工艺路线中的中间体、终产API和药物制剂中所含有的杂质提供更可靠的事实依据。目前，国内杂质标准品的定量研究，主要采用两种方法：质量平衡法，包括热重分析（Thermogravimetric Analysis，TG或TGA）技术以及水分加溶剂残留技术；另外就是定量核磁（Quantitative Nuclear Magnetic）方法。在SINCO药物标准品研究和销售中，很多客户会要求选择上述方法之一来对要购买的药物杂质进行定量分析。

作为一门近年来比较热门的分析技术，如果不能很好地理解它的技术特点和要求，难免会引起认知上的困扰和检测结果的准确性，影响与客户的顺利沟通。结合我们工作中遇到的一些问题，糅合相关信息资料，抛砖引玉，谈谈我们对定量核磁的一些浅显认识。

整个定量核磁的检测过程包括：待测样品和标准样品（内标物）的准备，样品的称量，配（氘代溶）液和转移，进行qNMR检测，数据处理与计算这五个步骤（图1）。我们知道分析误差是可以叠加的，分析过程中每一个步骤产生的误差，会最终加合到一起，所以需要从最开始的样品称量就要力争免除不必要的误差。

图1. qNMR检测流程

具体来说，称量的时候要做到如下要求：

1.使用按规范校准过的超微量天平（即十万分之一天平）；

2.称量前要清洁桌面；

3.称量前要把天平的称量台面清洁干净；

4.称量时使用镊子，而不是直接用手（手指会沾染样品，造成样品量损失）；

5.在第一次称量前，先将一个空样品瓶放在天平称量台面数分钟；

6.检查天平附近有没有磁性物体；

7.用边缘比较薄的样品瓶称量；

8.称量前，轻轻地敲击样品瓶，使得粘附的样品抖落到瓶底；

9.样品瓶在称量台上的时候，不要往瓶里加样品；

10.称量时完全关闭天平门，杜绝气流的影响；

11.调零前，要等天平显示数据先稳定下来；

12.将样品瓶储存在天平附近；

13.为避免误差过大，样品称量的量>10 mg为宜。

PART1---标准样品或内标物的选择：

标准样品或内标物通常结构简单，有一组或两组核磁出峰。具有较高的纯度（≥99%），吸湿性不强，化学性质稳定，可以长久保存，不挥发，且溶于指定的氘代溶剂中，不与待测样品的定量峰互相干扰重叠。因为有部分内标物仍会微量吸潮，所以内标物要求置于干燥器中保存。

下面表格是几种常用内标物的相关数据归纳，可以供研究人员参考选择：

表1：常用定量核磁标准品

PART2---氘代溶液配制：

氘代溶剂一般根据内标物及待测样品的性质来定。尽可能消除活泼质子的影响，使样品完全溶解：

1. 不含活泼质子的非极性化合物，可选用氘代氯仿做溶剂；

2. 含活泼质子的极性化合物，常用的溶剂有DMSO-d6+D2O(加重水是为了消除活泼质子的影响)、D2O和CD3OD等；

3. 如果用DMSO-d6+D2O作溶剂，一般两者的比例为5:1。两者比例可做适当调整，保证混合样品完全溶解；

4. 既不溶于有机溶剂，也不溶于水，比如氨基酸类两性化合物等，可以采用DMSO-d6/D2O+酸/碱的方法。需要保证酸/碱不会影响待测物和内标的稳定性；

5. 对于一些特殊结构的样品，如果其特征信号在水峰附近，很难保证基线的水平，会影响测定结果。可用的方法是加入TFA移除水峰。需要保证TFA不影响待测物的稳定。

PART3---qNMR检测：

进行qNMR检测的时候，因为考虑到要对峰面积精准积分，所以检测方法的一些数据设定也有要求（核磁检测软件中进行设置，此处不做介绍）。一般要求D1>5T1；S/N>150 (即信噪比)。T1（即弛豫时间）一般为1s，D1（即延迟时间）一般选5-10s。延迟时间（D1）直接影响激发核能否恢复至平衡基态，而能否恢复基态影响核磁的响应信号。因此合适的D1对qNMR定量结果影响较大。但过长的D1又会增加单次扫描所需的时间。

在实际操作中，如需缩短延迟时间，可以通过加入顺磁物质。而如果D1过短，可以引入校正因子f校正D1时间不足导致的定量偏差。就扫描时间而言，相同操作条件下，灵敏度与扫描次数呈正比。如果扫描次数太少，数据重现性会较差。但如果扫描次数过多，则会造成试验效率低下。因此qNMR定量需优化扫描次数，是扫描时间和灵敏度达到最佳平衡。

PART4---数据处理与计算：

牵扯到数据分析的时候，因为待测样品往往出峰复杂，所以选择哪个或哪几个核磁峰为定量峰也有讲究。一般尽可能保证信号峰间的基线分离；定量峰峰形尽可能类似；定量峰尽可能靠近（如果标准样品峰与定量峰相隔太远，对基线校正的要求极高，误差大）；二者峰面积尽可能接近；卫星峰尽可能不干扰测定结果等。另外标准样品和待测样品的摩尔量（有效）要接近，不然误差也是比较大的。这些对于含量比较高的API或其工作对照品，影响会比较明显。

对于待测样品和标准样品，其中一个或两者均有一个以上可用定量峰的情况下，需做合理选择。如果同一成分的可用定量峰的积分值接近，可取其平均值；如果其积分值有一定差距，建议采用积分值小的那个，一般结果比较合理。

以上是SINCO药物标准品相关分析研究人员在定量核磁的检测和分析中，综合有关文献信息，加上自身经验的总结，得到的一些浅薄认知，希望能和国内的众多标准品研究人员相互学习，共同进步。

Sinco Pharmachem（简称SINCO），专业为化学药物领域的科学家提供复杂有机小分子化合物、杂质对照品、API标准品、稳定同位素。

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