--细 胞 基 本 信 息---
细胞名称： HL-60(人原髓细胞白血病细胞)
细胞别称： HL 60; HL60
细胞货号： SNL-040
生长特性： 悬浮
培养条件： 1640+10% FBS+1% P/S
培养环境： 空气，95%； 二氧化碳 (CO2)，5%；37℃
细胞简介： HL-60细胞是源自一位患有急性粒-单核细胞白血病的36岁白人女性的早幼粒细胞系。HL-60细胞自发分化，丁酸盐、次黄嘌呤、佛波醇、肉豆蔻酸、DMSO(1%-1.5%)、放线菌素D和视黄酸均可以促进分化。HL-60细胞表现出吞噬活性，并对趋化刺激有响应；HL-60细胞致癌基因myc表达阳性。该细胞系可用于免疫紊乱和免疫学研究。
细胞正常生长形态照片
HL-60细胞培养注意事项
- HL-60细胞悬浮圆形生长，偶有小聚团，属于正常现象，无需吹散；
- 少量细胞附着瓶底属于正常现象，可将悬浮细胞转移至新瓶，丢弃贴壁的细胞；
- 圆形透亮、细胞膜完整的细胞是活细胞，如果无法判断，可以取少量细胞用台盼蓝染色后计数确定细胞活率；
- 接种密度建议在10万-50万细胞/mL之间为宜，密度过低或过高都可能造成细胞状态变差；
- 复苏时需尽快离心去除DMSO，避免DMSO刺激HL-60细胞发生分化；
- HL-60细胞生长需要稳定的环境，不频繁拿出培养箱，不频繁离心；
- 当细胞状态较差时，不建议对细胞进行离心，需换液时可采用半换液法（详细步骤见下文）
HL-60细胞换液方法
- 半换液法：
- 准备所需的培养基、离心管以及无菌枪头等；（培养基提前预热）
- 将培养瓶竖立静置一段时间，待细胞沉底；（肉眼观察细胞沉底情况）
- 小心吸出一半的培养基，转移到离心管；
- 900-1000rpm 3min离心，离心管里若有细胞，则用新鲜培养基重悬后放回原瓶；
- 原瓶补充一半的新鲜培养基，混匀细胞，放入培养箱中继续培养。
- 离心换液法：
- 准备所需的培养基、离心管以及无菌枪头等；（培养基提前预热）
- 将所有细胞悬液转移至离心管中；
- 900-1000rpm，3min离心；
- 培养瓶中加入适量新鲜培养基；（T25推荐10mL，T75推荐20mL）
- 离心完成后弃上清，加适量新鲜培养基轻轻重悬细胞沉淀，将细胞悬液接种回培养瓶中，混匀细胞，放入培养箱中继续培养。
HL-60细胞传代方法
- 离心法：
1.取少量细胞悬液进行计数确定细胞密度，密度80万/mL以上传代，并根据计数结果确定传代比例；
2.准备所需的培养基、离心管以及无菌枪头等；（培养基提前预热）
3.用移液器吸取培养瓶内细胞悬液转移至离心管中；
4.900-1000rpm，3min离心收集细胞；
5.在培养瓶中加入适量新鲜培养基；（T25推荐10mL，T75推荐20mL）
6.离心完成后，弃离心管内上清，然后加入适量新鲜培养基，轻轻重悬吹散细胞，将细胞悬液均匀接种至培养瓶中，轻轻混匀后将细胞放入培养箱中继续培养。
Tips：悬浮细胞通常都偏脆弱，注意控制吹打力度尽可能轻柔和离心转速以及时间不要过高，避免细胞受机械损伤。
- 直接分瓶法：
- 取少量细胞悬液进行计数确定细胞密度，密度80万/mL以上传代，并根据计数结果确定传代比例；
- 轻轻摇晃培养瓶，使细胞均匀分散；
- 用移液器吸取培养瓶内细胞悬液，均分到若干个新培养瓶中，每瓶再补充适量的新鲜培养基，轻轻混匀后将细胞放入培养箱中继续培养。
Tips：用直接分瓶法传代1-2次后需进行离心传代。
HL-60细胞冻存方法
- 取少量细胞悬液进行计数确认细胞密度。
Tips：若冻存前培养基已经变黄，先换液静置培养4h左右，待细胞活力稳定后再进行冻存。
- 准备所需的培养基、PBS、血清、DMSO、离心管以及无菌枪头等；（试剂需提前预热）
- 根据收集到细胞量，配制相应量的冻存液，并准备相应数量的冻存管，在冻存管上标志细胞名称，代次，冻存时间等信息。推荐冻存液配方：92%FBS+8%DMSO或92%完全培养基+8%DMSO；冻存密度200-300万细胞/mL/管。
Tips：冻存密度过低将导致复苏后状态不佳。
- 将细胞悬液转移至离心管中1000rpm，3min离心收集细胞；
- 离心完成后弃上清，加入相应量的配置好的冻存液轻轻重悬混匀细胞，将细胞悬液分装至冻存管中。注意吹打力度，不要产生过多气泡；
Tips：加入冻存液混匀细胞后及时分装并将细胞降温冻存，以减少DMSO对细胞的毒性。
- 将细胞放置程序降温冻存盒中，再将冻存盒转移至-80℃冰箱进行降温冻存。
- 次日复苏一管检查冻存效果，确认没问题后及时将冻存细胞放置液氮中保存，细胞在-80℃冰箱放置时间不要超过3天。
HL-60细胞复苏方法
- 提前将水浴锅预热至37℃，培养基复温至室温或37℃，离心机设置好转速；
- 将冻存细胞从液氮或-80℃冰箱中取出，迅速置于37℃水浴，快速摇晃至完全融化，融化时间1min左右；
- 直接将冻存管900-1000rpm 2min离心，同时在培养瓶中加入适量新鲜培养基；
- 离心完成后弃上清，吸取1mL新鲜培养基轻轻重悬细胞，吹散细胞后接种到培养瓶中；
- 使用十字法或8字法将细胞混匀后置于培养箱中培养。
Tips：
- 若液氮或冰箱距离细胞房较远，细胞需要放在干冰或冰盒上运送至细胞房。
- 细胞融化后需尽快离心去除DMSO，避免DMSO刺激HL-60细胞发生分化。
- 整个细胞复苏过程在尽可能5-10min内完成。
HL-60细胞收货攻略
- 拆封包装盒，确认细胞，说明书等是否齐全，收货细胞名与所购买细胞是否符合；
- 观察细胞培养瓶是否完好，有无漏液，培养瓶内培养基是否有肉眼可见的絮状物或者浑浊等，发现异常及时拍照联系销售人员；
- 确认无异常后，将培养瓶表面消毒，然后撕掉封口膜竖立放入培养箱平衡4h左右，让悬浮细胞沉下培养瓶底部；
- 平衡过程中可以仔细阅读细胞说明书，知悉细胞所需培养体系，培养环境以及培养注意事项等；
- 平衡完成后竖立取出细胞培养瓶，此时大部分细胞沉在培养瓶底部，小心吸取上清至离心管中，保留10mL左右培养基在培养瓶内，小心操作，尽量不要吸到沉在底部的细胞；
- 将离心管1200rpm，5min离心收集未沉下培养瓶底部的细胞，上清可以4℃保存，后续用于培养细胞，以平稳过度到自己的培养基。将收集到的细胞接种至原培养瓶；
- 轻轻混匀细胞，取100-200ul细胞悬液进行计数，根据计数结果调整细胞培养密度。然后置于培养箱中培养。
常见问题及解决方案
NO.1细胞密度怎么计算的？
严格意义上，细胞密度需要收集细胞悬液计数细胞数量，但在实际培养过程中，并不需要为了精确控制细胞数量而计数。因此，常用的细胞密度指细胞相对于最大生长密度的比值，贴壁细胞可以粗略的用细胞所占培养容器底面积百分比表示，即显微镜下观察培养容器底部，有细胞的区域占总区域的百分比值，当然这种表达方式受限于单个细胞生长不同密度时所占面积不同导致并不严谨，但也是相当直观、简便的表现细胞状态的一种方式。
NO.2培养过程中细胞碎片较多怎么处理？
- 细胞内的黑色颗粒是细胞外分泌泡及细胞器折光，这个属于细胞自身特性，无法清除也无法改变，大部分细胞都会有这种现象，只是不同细胞颗粒多少有区别，细胞培养体系不适应、营养缺乏、渗透压异常等均可能导致细胞内颗粒增加，建议使用合适的培养条件。
- 细胞外的黑色颗粒大部分是细胞碎片和细胞代谢产物，可通过900-1000rpm，3min离心以去除部分碎片。少量碎片不影响细胞生长，不建议频繁离心。
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