随着医学科学的发展及人们对深部真菌感染的重视，越来越多的新技术用于临床真菌的检测和鉴定，随机扩增DNA多态性（RAPD）是在PCR基础上发展起来的一种新的基因分型方法。本文综述了假丝酵母菌RAPD分析技术应用的研究进展及前景。

 

　　 RAPD 假丝酵母菌 基因分型

　　近年来，随着肿瘤、自身免疫病、器官移植、糖尿病、获得性免疫缺陷综合征（AIDS）等患者的不断增多，侵入性诊断治疗手段的广泛实施，各类免疫抑制剂和广谱、超广谱抗生素的大量使用，临床上真菌感染呈明显上升趋势［1］，其中假丝酵母菌在医院真菌感染中最常见，占80%以上［2］，故快速、准确地对其鉴定、分型并分析该菌种间、种内的亲缘关系对研究假丝酵母菌的致病性、药物敏感性、预防监测流行病学调查具有重要意义。传统的真菌分型方法主要是表型分型如形态学法、血清学法、药物敏感性分型等，但耗时费力，易受环境及人为因素的影响，鉴别力弱，稳定性差。随着分子生物学的发展，DNA分析技术广泛应用于病原微生物的检测，如：限制性片段长度多态性分析（RFLP），单链构象多态性分析（SSCP），随机扩增DNA多态性（RAPD），脉冲场凝胶电泳等，其中RAPD技术具有简便快速，短期内可以分析大量样本等特点，在医学真菌研究中显示出巨大的潜力。

 

　　1 RAPD的基本原理

 

　　随机扩增多态性DNA分型法（random amplied polymorphic DNA,RAPD）又称任意酶链反应(Arbitrily primer PCR,AP-PCR)，由Williams等［3］于1990年创用，该方法利用任意10个左右的寡聚核苷酸链作引物，以所研究的基因组DNA为模板进行PCR扩增，扩增产物（即DNA片段）通过琼脂糖凝胶电泳，经溴化乙腚（EB）染色检测多态性，在扩增条件相同的情况下，不同种属的个体成相差明显，扩增产物呈现不同电泳带型，同种内不同个体由于基因突变、插入、缺失或置换影响引物的特定结合位点，导致DNA扩增条带增多、减少或长度改变，而同一引物的扩增产物中电泳迁移率一致的被认为具有同源性，因此不仅反映生物个体之间的遗传稳定性，也能同时清晰敏感地反映出遗传差异。

 

　　2 RAPD技术的主要优势

 

　　RAPD方法建立在PCR基础之上，因此具有模板用量少、技术简单、灵敏度高和特异性强等优点，但与其他DNA多态分析方法相比较，还有其独特的优势。

 

　　，RAPD勿需知道模板DNA任何序列信息，对其进行扩增，构建不同种、不同菌株的基因指纹图谱，进而分析DNA的多态性，这是其他方法进行此类研究所不能比拟的［4］。

 

　　第二，鉴别力强。Bostock［5］等将RAPD与PFGE、REA-RFLPs进行比较分析发现15株白假丝酵母菌中，PFGE产生14个电泳核型，E.CORI-RFLPs产生7种不同的DNA型别,而RAPD则能分出13个亚型，是一种快速简捷的方法并有着与PFGE类似的分辨力。随后许多学者进行了类似的研究［6-8］，对RAPD予以高度评价，认为目前已有的分型方法中，RAPD可能是位选择。

 

　　第三，RAPD技术无需DNA探针，不涉及Southern杂交，放射自显影或其他技术，操作步骤少，实验周期短，成本较低，能在较短的时间内筛选大量样品。

 

　　3 RAPD技术在假丝酵母菌研究中的应用

 

　　3.1 用于种间及种内菌株分型 假丝酵母菌是条件致病菌感染中最常见菌群，其种间及种内分型具有重要的流行病学及临床意义。Robert［9］等应用1个10bp随机引物RAPD方法将分离自非相关患者不同解剖部位的32株白假丝酵母菌分成22个不同的DNA型别。项明洁等［10］采用优化实验条件对自上海瑞金医院临床分离的22株酵母菌菌株进行RAPD分析，从而得到假丝酵母菌具有不同的扩增指纹，进而揭示了RAPD在酵母菌分型中的应用。廉翠红等［11］利用两条随机引物RAPD方法，将来源于不同阴道念珠菌病患者的97株临床分离株分别分成19个和21个型别。可见，RAPD具有很好的分型能力。

 

 

　　3.2 分析种间和种内菌株间的亲缘关系 李冬梅等［12］对48株致病性酵母菌的多态性及亲缘关系研究后发现，RAPD带型可清楚显示假丝酵母菌种间及种内的差异，亲缘关系研究也表明除季也蒙假丝酵母菌外，其他常见几种致感染的假丝酵母菌种间系数为82%~87%，同种不同菌株间的相似系数＞90%［12］。张晓梅等［13］对兰州医学院第二附属医院的阴道念珠菌病患者阴道的45株临床分离株进行RAPD分析，并将扩增带型进行聚类分析，将30株白假丝酵母菌分成7群19个亚群，15株非白假丝酵母菌鉴定到种的水平。白假丝酵母菌种内不同菌株间的相似系数在90%以上，不同种假丝酵母菌株间的相似系数介于80%~90%。可见，RAPD可以较好地显示种间差异及种内多态性。

 

 

　　3.3 研究种内不同基因型菌株与某些疾病临床表现的关系 沈雪敏等［14］用RAPD分型法观察上海地区LP（口腔扁平苔癣）患者、OC（口腔念珠菌）患者和健康人的白假丝酵母菌分离株的基因同源性，以及同组各菌株间的基因同源性，发现LP组与OC组白假丝酵母菌电泳RAPD带型相似性不高，说明在这两种口腔粘膜病中分离到的白假丝酵母菌致病性不同，提示不同基因型白假丝酵母菌的定植可能与口腔粘膜病的种类有关。曾晰等［15］对四川地区的健康人和OLP（口腔扁平苔癣）患者的口腔白假丝酵母菌分离株的RAPD基因分型结果表明，健康组、糜烂型OLP患者和非糜烂型OLP患者的白假丝酵母菌分离株的基因型构成不同，提示具有特定基因型的白假丝酵母菌与OLP的发生、发展可能相关，RAPD技术可在基因分型水平上为探讨假丝酵母菌的致病性提供依据。

 

　　3.4 追踪感染来源，确定感染方式 Hanaula等［16］对40名2个月到24个月的儿童进行40个月的随访取样，用RAPD检查发现，有3对母子之间白假丝酵母菌有垂直传播的可能。Ahmad等［17］通过RAPD的方法证实1例血液系统近平滑假丝酵母菌感染的患者，其感染菌株与两位护士手上携带的为同一株近平滑假丝酵母菌，因此推测假丝酵母菌感染也有外源性的，特别是近平滑假丝酵母菌感染。Robert等［8］采用RAPD法对一个烧伤单元在9个月期间分离自18例患者的84株白假丝酵母菌进行了流行病学调查分析，结果鉴定出7个DNA型别并揭示了白假丝酵母在病房之间和患者之间的相互传播。

 

　　综上所述，在多种基于PCR的分子指纹研究方法中，RAPD技术在显示DNA多态性方面具有明显的优势，已被成功应用于假丝酵母菌鉴定、分型及遗传特征研究，但RAPD对实验条件敏感产生带型过多，为了减少鉴别上的人为误差，将RAPD结果扫描并用计算机软件进行分析，提供了一种省时省力的评估方法，同时还能形成数据库以贮存备用。相信随着科研人员对RAPD技术的不断深入和了解，试验条件的逐步规范化，RAPD势必成为医学致病真菌检测和鉴定的重要手段，并为真菌感染的临床诊断、预防和治疗提供更有价值的信息。

发布日期：2016/3/25 10:02:16