순도시험
(1) 비소 : 이 품목을 비소시험법에 따라 시험할 때, 그 양은 4.0ppm 이하이어야 한다.
(2) 납 : 이 품목 5.0g을 취하여 원자흡광광도법 또는 유도결합플라즈마발광광도법에 따라 시험할 때, 그 양은 5.0ppm 이하이어야 한다.
(3) 대장균군 : 이 품목은 「식품의 기준 및 규격」 일반시험법의 미생물시험법 중 대장균군에 따라 시험할 때, 제품 1g당 30 이하이어야 한다.
(4) 살모넬라 : 이 품목은 「식품의 기준 및 규격」 일반시험법의 미생물시험법 중 살모넬라균시험법에 따라 시험할 때, 음성(-)이어야 한다.
(5) 대장균 : 이 품목은 「식품의 기준 및 규격」일반시험법의 미생물시험법 중 대장균에 따라 시험할 때, 음성(-)이어야 한다.
활성시험법
분석원리 : 본 역가시험은 온도 37℃, pH 5.5에서 p-nitrophenyl-α-D-galactopyranoside 기질의 15분간의 가수분해에 근거를 두고 있다.
시험용액의 조제 : 검체를 물에 녹여 최종 희석액 1mL가 0.001～0.003 galactosidase unit를 함유하도록 시험용액을 조제한다.
시험조작 : 20×150mm 마개가 있는 시험관 몇 개를 일조로 하여 기질용액 2.0mL씩을 취하여 37±0.2℃의 수욕조에서 15분 이상 유지하여 온도를 평형시킨다. 기질용액과 동일한 조건에서 효소시험용액 1.0mL씩을 정확히 취하여 가하고 흔들어 혼합한다. 정확히 15분 후 붕산나트륨완충액(pH 9.7) 5.0mL를 각 시험관에 가하고 흔들어 혼합한 후 물을 대조액으로 하여 405nm에서 흡광도(AS)를 측정한다. 따로 효소공시험으로 효소시험용액 1mL씩을 차례로 취하여 붕산나트륨완충액(pH 9.7) 5.0mL를 가하고 흔들어 혼합한 다음 기질용액 2.0mL를 각 시험관에 가하여 혼합한 다음 효소시험용액과 동일하게 조작하여 파장 405nm에서 흡광도(AB)를 측정한다. 다음의 계산식에 따라 효소제의 역가를 구한다.
역가(GALU/g) =(AS–AB) × F/ε × T × M
AS : 시험용액의 흡광도
AB : 대조액의 흡광도
F : 시험용액의 희석배수
T : 반응 시간(min)
M : 시험용액 1mL에 함유된 검체의 량(g)
ε : 표준 4-니트로페놀용액에 따라 측정된 흡광계수
역가의 정의 : 1 α-Galactosidase unit(GALU)는 상기시험조건 하에서 분당 1μmol의 p-니트로페놀을 유리시키는 효소의 양이다.
시 액
초산염완충액(pH 5.5)
A액 : 11.55mL의 빙초산을 물에 녹여 1,000mL로 한다.
B액 : 초산나트륨 16.4g을 물에 녹여 1,000mL로 한다.
A액 7.5mL와 B액 42.5mL를 혼합하고 A액 또는 B액을 사용하여 pH 5.5로 조절하고 물을 가하여 전량을 1,000mL로 한다.
기질용액 : p-니트로페닐-알파-D-갈락토피라노시드(p-nitrophenyl-α-D-galactopyranoside) 0.0383g을 초산염완충액에 혼합하고 희석시켜 100mL로 한다.
붕산나트륨완충액 : 붕산나트륨 47.63g을 미지근한 물에 용해시키고 실온으로 식힌 다음 4N 수산화나트륨 20mL를 가한다. pH농도를 4N 수산화나트륨으로 9.7까지 조절한 후 희석시켜 2,000mL로 한다.
4-니트로페놀표준원액 : 미리 건조시킨 4-니트로페놀 68.83mg을 정밀히 달아 물에 녹여 1,000mL로 한다. 이 용액 1mL에는 0.5μmol의 니트로페놀을 함유한다.
표준 4-니트로페놀용액 : 세 개의 시험관에 4-니트로페놀 표준원액을 각각 4mL, 8mL 및 16mL를 취하여 물을 가하여 50mL로 정용한다. 이들 희석액은 1mL당 4-니트로페놀이 각각 0.04, 0.08 및 0.16μmol을 함유한다. 시험관 5개를 일조로 하여 기질용액 2.0mL씩을 취하여 각각 다섯 개의 시험관에 가한 다음 여기에 표준 4-니트로페놀용액 1mL씩을 네 개의 시험관에 차례로 가하고, 다섯째 시험관에는 표준원액 대신 물 1.0mL를 가한다. 다시 각각의 시험관에 붕산나트륨완충액 각각 5.0mL씩을 가한 뒤 흔들어 혼합한 다음 이들 용액에 대해 물을 대조액으로 하여 액층 1cm, 파장 405nm에서 각각의 흡광도를 측정하고 4-니트로페놀 μmol수에 대한 검량선을 작성한다. 각 희석액의 흡광도를 4-니트로페놀 농도(μmol/mL)로 나누어 표준 4-니트로페놀용액의 평균 흡광계수(ε)를 구한다.
ε = AN/C
AN : 4-니트로페놀 표준용액의 흡광도
C : 4-니트로페놀의 농도(μmol/mL)
흡광계수 값은 18.3 근사치가 얻어져야 한다.
