大鼠肝窦内皮细胞

肝窦内皮细胞（SEC）是肝脏内所占比例最高的非实质细胞，位于肝窦腔与肝细胞之间，具有物质转运、吞噬、抗原提呈、免疫耐受等功能。SEC由于拥有一般细胞所没有的窗孔结构、细胞间连结松散、内皮下缺少基底膜而使其具有高度通透性，从而达到快速交换各种大小分子的目的。

1.将15ml离心管插入盛有足量碎冰的冰盒中，紫外消毒15min；4℃预冷离心机。

2.复苏培养基放碎冰中充分预冷，铺板培养基放入38℃恒温水浴锅中充分预热。

3.将冻存的细胞从冷藏位置迅速转移至38℃恒温水浴锅中。尽可能多的浸入38℃水中，顺时针水平摇动，但必须确保冻存管管盖保持在水面以上。

4.解冻冻存管约90-120s，至冻存管中只有少量碎冰漂浮即可。

5.用75%酒精消毒冻存管，并将其转移到生物安全柜。

6.用宽口枪头将大鼠肝窦内皮细胞重悬（轻轻吹打2次），并转移至预冷的15ml离心管中（注意：冻存管与枪头上残留细胞，可用1ml复苏培养基清洗冻存管与枪头）。

7.向细胞悬液逐滴加入预冷复苏培养基，每1ml细胞悬液加入10ml复苏培养基（注意：前3ml要缓慢逐滴加入并轻微摇晃，后面7ml可加快速度），最后轻微上下颠倒1次混匀。

8.300×g，4℃离心5min，去上清并用培养基重悬。

9.沉淀的细胞用肝窦内皮细胞培养基重悬并定容至4ml，用台盼蓝排除法测定细胞的存活率和细胞总量。

10.将细胞按3×104cells/cm2接种至胶原包被培养板中。摇匀，在37℃/5%CO2培养箱中培养，24h后换液。