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单细胞全基因组扩增试剂盒

描述操作步骤

单细胞全基因组扩增试剂盒

CAS号:
英文名:Single cell whole genome amplification kit
中文名:单细胞全基因组扩增试剂盒
CBNumber:CB45537253
分子式:
分子量:0
MOL File:Mol file

单细胞全基因组扩增试剂盒性质、用途与生产工艺

描述单细胞全基因组扩增试剂盒基于多重链置换扩增的Phi29 DNA聚合酶等温扩增体系，Phi29 DNA聚合酶是从Bacillus subtilis噬菌体Phi29中克隆出的嗜温DNA聚合酶，利用基因重组技术，在大肠杆菌中进行表达后经多次纯化分离而得。Phi29 DNA聚合酶具有很强的链置换活性，可实现对DNA复杂结构的解链与复制。同时具有高效的DNA合成能力，可连续合成多达70kb的DNA片段。Phi29 DNA聚合酶具有很强的3’→5’外切酶活性，保真度高于绝大多数高保真酶，因此Phi29 DNA聚合酶特别适合用于全基因组扩增。
单细胞全基因组扩增
本试剂盒可以实现单个细胞或者少量样本的全基因组无差别扩增，一个反应可以达到40ug的全基因组DNA。低质量样品会影响DNA的最终产量，如果以DNA样品为模板，需避免使用降解的DNA作为起始模板。
操作步骤适用于以1-1000个新鲜配制的细胞样品作为模板，以保证起始基因组的完整性。
1、将细胞用PBS洗涤三次。
2、取一倍体积的细胞，加入一倍体积的Cell Lysis Buffer，轻轻混匀（勿涡旋混匀）后置于冰上放置10min。
3、加入一倍体积的Neutralization Buffer，轻轻混匀，勿涡旋混匀。
4、从上述混合液中取3μL样品，加入7μL无菌水，10μL Reaction Buffer。将20uL上述处理后的样品加入到25uL GenoPhi29 Buffer中。
注意：如果不进行后续反应，需冰上放置。
5、加入5μL GenoPhi29 Enzyme，30℃反应3h。
注意：65℃，10min失活Phi29 DNA聚合酶。
6、扩增产物是高浓度基因组DNA，需要将扩增产物用无菌水或者TE缓冲液进行稀释后进行下游实验。