细胞裂解液

1.培养细胞

(1)取出细胞裂解液,待融化后,颠倒混匀数次,可适量分装冻存。如果实验需要,按比例加入PMSF(使其最终浓度为1mM)或其他蛋白酶抑制剂,混匀,立即使用。

(2)贴壁细胞,去除培养液,用PBS、生理盐水或无血清培养液洗2-3遍(如血清中的蛋白没有干扰,也可以不洗)。按6孔板每孔加入100-200微升的比例加入裂解液。用枪吹打数下,使裂解液和细胞

充分接触。通常裂解液接触细胞数秒后细胞就会被裂解。

(3)悬浮细胞,收集培养细胞,离心去除培养液,用PBS、生理盐水或无血清培养液洗2-3遍(如血清中的蛋白没有干扰,也可以不洗),用手指把细胞用力弹散,按6孔板每孔细胞加入100-200微升的比例加入裂解液。如果细胞数量较大,应按50-100万细胞/管分装或根据细胞数量按比例增加裂解液。

用手指轻弹管底以促进裂解液和细胞充分接触,裂解完全时应无明显的细胞颗粒。

(4)裂解物经10,000-14,000g离心3-5分钟,取上清,即可进行后续的PAGE、Western、免疫沉淀和免疫共沉淀等操作。

(5)裂解液用量说明:通常6孔板每孔细胞加入100微升裂解液已经足够,但如果细胞密度非常高可以适当加大裂解液的用量到150微升或200微升。

2.组织样品

取Ep管,分别称重标记,把组织剪切成小块装入Ep管中,称重。按每20毫克组织加100-200微升的比例加入裂解液(如裂解不完全,可以适当增加裂解液的用量;如需要的蛋白样品浓度较高,可以适当减少裂解液的用量)。用手握式电动组织细胞匀浆器匀浆约1分钟或直至充分裂解。10,000-14,000g离心3-5分钟,取上清,即可进行后续的PAGE、Western、免疫沉淀和免疫共沉淀等操作。

如果组织样品本身非常细小,如淋巴细胞,可直接加入裂解液裂解,通过振荡(Vortex)以使样品裂解完全。