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苯酚-氯仿-异戊醇混合物的制备方法

发布日期:2019/8/15 9:38:46

背景及概述[1]

苯酚-氯仿-异戊醇混合物常用作分析提取液用于提取DNA、多糖等。

制备[1-4]

苯酚-氯仿-异戊醇混合物应用举例如下:

1)用于一种适用于全基因组测序的产糖被细菌基因组DNA的提取,向产糖被细菌的培养物中加入提取缓冲液和溶菌酶,37℃下静置10min,再加入蛋白酶K,65℃下静置1h;加入苯酚-氯仿-异戊醇的混合溶液,抽提;加入氯仿-异戊醇混合溶液,抽提;加入冷乙醇和醋酸钠,离心,沉淀经乙醇洗涤后室温干燥,加DNA提取缓冲液溶解;加入RNA酶,37℃下静置10min;加入PEG6000,混匀,50℃下静置10min;加入苯酚-氯仿-异戊醇的混合溶液,抽提;加入氯仿-异戊醇混合溶液,抽提;加入冷乙醇和醋酸钠溶液,离心,沉淀经乙醇洗涤后室温干燥,加ddH2O或者TE缓冲液溶解,即为提取到的DNA溶液。

2)一种从沙冬青提取高质量基因组DNA的方法,包括如下步骤:(1)植物材料液氮速冻研磨成粉;(2)加DNA提取液并加蛋白酶K至20μg/mL,65℃保温;(3)离心收集上清液,加等体积的苯酚:氯仿:异戊醇混合液抽提,再离心收集上清液;(4)加0.6~0.8倍体积异丙醇沉淀DNA;乙醇洗涤,部分干燥后溶于TE缓冲液,得DNA粗提液;(5)向DNA粗提液中加入NaCl至0.5mol/L,再加入CTAB/NaCl溶液,并加入RNase-A至终浓度10μg/mL,65℃保温;(6)依次用等体积苯酚:氯仿:异戊醇混合液和等体积氯仿:异戊醇混合液抽提,收集上清液;(7)加0.6~0.8倍体积异丙醇沉淀DNA,再用乙醇洗涤,部分干燥后溶于TE缓冲液,得到高质量的DNA提取液。本发明可以从沙冬青提取高质量的基因组DNA。

3)一种从环境样品中提取纯化总细菌的方法,它包括如下操作步骤:取环境样品,加入水或缓冲液,混匀;加入苯酚-氯仿-异戊醇混合液,混匀,待溶剂分层,移取上层备用;将移取的上层进行离心,弃上清,保留沉淀;将沉淀洗涤至基本无色,重悬菌液即可。本发明方法简化了PCR检测的前处理步骤,省去了繁琐的DNA提取步骤,消除了PCR反应的干扰物质,直接用本方法处理得到的稀释菌液或菌落为模板进行PCR扩增,灵敏高,特异性好,检测时间短,大大降低了检测成本。

4)一种马齿苋多糖的提取方法。所述方法包括以下步骤:(1)马齿苋原药材粉碎后,采用乙醇或石油醚进行回流提取两次,每次2h,抽滤,烘干得到马齿苋药材粉末备用。(2)马齿苋药材粉末置于高压灭菌锅中进行提取,设定温度范围105-121℃,提取时间1h。(3)提取出的粗多糖溶液,采用等体积的苯酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)进行萃取去除蛋白质,留取上清水相溶液,将溶液进行旋蒸,采用无水乙醇沉淀过夜,离心分离获得多糖。采用本发明方法提取的多糖产量比传统水浴法提取的多糖量高出89%-96%,同时本发明方法所采用的设备简单易获取,纯化多糖的方法简单重复性好,整个过程提取成本低廉,适合大规模工业生产使用。

主要参考资料

[1]CN201210145537.8一种适用于全基因组测序的产糖被细菌基因组DNA的提取方法

[2]CN201510875261.2一种从沙冬青提取基因组DNA的方法

[3]CN201611152634.4一种从环境样品中提取纯化总细菌的方法

[4]CN201810700186.X一种马齿苋多糖的提取方法

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