胰激肽原酶的作用和用途

背景及概述^[1]

胰激肽原酶白色或微黄色粉末，有特殊的气味，易溶于水，不溶于乙醚；对热、酸，碱、氧化剂均不稳定。最早从哺乳动物胰腺中提取的一种蛋白水解酶，是在激肽体系当中重要的一个环节，胰激肽原酶在组成上是由4种糖与18种氨基酸所组成的。其外观呈白色粉末状，无臭，能够在水中溶解。在临床当中胰激肽原酶在临床上能够起到促进血液循环，促进血管扩张的作用，被广泛的运用在心血管疾病当中。

作用和用途^[2]

胰激肽原酶是人体组织和哺乳动物中的一种激肽释放酶，在体内以无活性的前体一激肽释放酶原形式存在，能使激肽原降解成激肽。激肽能扩张血管和毛细血管，增加血管通透性，改善微循环，起调节血压等作用，此外还能降低心肌耗氧量。此酶也是一种活化因子，能把纤溶酶原激活成纤溶酶，把不溶性的纤维蛋白水解成可溶性小肽，从而导致血栓溶解，但此作用比尿激酶缓慢。还可调节和降低高血压。口服吸收较迅速，t_1/2约7小时，经肾排泄。

用于微循环障碍、闭塞性动脉硬化、高血压、脑动脉硬化或血栓、冠心病、视网膜血流障碍、血栓闭塞性脉管炎、间歇性跛行、老年性四肢冷感、知觉异常等。脑血管病重症急性者，因作用缓慢，应配合其他药物治疗。

不良反应^[2]

有疼痛反应、过敏反应。肿瘤、颅内压增高、心力衰竭、急性心肌梗死以及急性出血者禁用，脑出血或其他出血倾向者慎用。

剂量和用法^[2]

注射用血管舒缓素：10U；肠溶片剂56U。高血压以及冠心病等：口服，2片/次，3次/日，饭前服，6周为1个疗程，肌内注射或皮下注射，临用时溶解(10U/1.5ml)，10～20U/次，1～2次/日。脑动脉硬化症、脑血栓形成和老年痴呆症等：口服，2～4片/次，3次/日，饭前服1个月为1个疗程，连用2个月；肌内注射或皮下注射，临用时溶解(10U/1.5ml)，10～20U/次，1～2次/日，疗程为1～2个月。眼底动脉硬化、视网膜静脉血栓、眼底出血、缺血性视乳头病变、视神经萎缩、糖尿病性视网膜病变等：口服，2片/次，3次/日，饭前服；眼结膜下注射，5U/次。血栓闭塞性脉管炎、闭塞性动脉硬化症、结节性血管炎、多发性大动脉炎、慢性下肢溃疡等：口服，1～2片/次，3次/日。饭前服，两个月为1个疗程。

制备^[3]

1. 传统工艺

先将0℃以下的丙酮加入猪胰脏中，于0℃左右脱水，制得干燥粉。用稀醋酸提取干燥粉，提取液加冷丙酮沉淀，乙醚脱脂，得沉淀物。此沉淀物用稀氯化钠溶液溶解，在pH8过滤，滤液加冷丙酮使浓度达40%，离心后清液中补加冷丙酮至浓度为60%，离心，洗涤沉淀并干燥即为酶的粗品。将粗品溶于pH4.5的稀醋酸盐缓冲液，离心，清液加入弱酸性阳离子树脂吸附，用pH4.5的氯化钠溶液洗脱，洗脱液透析脱盐，冻干，即得精品。此工艺可用丙酮脱水及时处理胰脏，保持酶活性，便于贮存，合并批量投料。然后利用pH8和pH4.5介质去除部分杂质，再用丙酮分级沉淀得粗品。胰激肽原酶的等电点为3.9~4.1，在pH4.5以下不稳定，故在pH4.5条件下以弱酸性树脂吸附。这里树脂与酶之间的结合部分是离子的，部分是疏水结合。改进传统工艺采用加入对酶有激活作用的Ca2+盐酸溶液取代醋酸提取干燥粉，由搅拌树脂吸附，改为柱色谱，明显提高了产品收率和比活。

2. DEAE-纤维素吸附工艺

丙酮制成干燥粉，用稀醋酸钠（pH6，内含CaCl2）提取，离心，上清液55℃处理5min，离心去沉淀，用氢氧化钠调pH至7，加丙酮沉淀、抽滤，滤液加水稀释。在稀释液中加DEAE-纤维素（pH7磷酸盐缓冲液平衡）吸附，氯化铵溶液洗脱，洗脱液用冷丙酮70%浓度沉淀，干燥得粗品。粗品溶解后调pH至5，上DEAE-纤维素色谱柱（pH5醋酸钠缓冲液平衡），用浓度较大的醋酸钠缓冲液洗脱，收集酶活性部分，减压浓缩，对蒸馏水透析。透析液调pH至6.7，DEAE-Sepharose CL-6B柱（pH6.7醋酸钠缓冲液平衡），用浓度较大的醋酸钠缓冲液洗脱，得2个活性峰，减压浓缩，蒸馏水透析，真空干燥得产品。此工艺是使介质的pH大于酶的等电点，用阴离子交换树脂利用不同pH进行纯化。对上述两种工艺加以分析，可以看出：（1）利用不同pH介质，用离子交换剂进行纯化是适当的。随着近年不断推出新的离子交换剂，宜选用更适当的吸附剂；（2）早年用透析去掉小分子杂质效率较低，可改用大型超滤设备，既可去掉小分子杂质，又可达到浓缩的目的；（3）在以胰脏为原料的生产过程中，Ca2+既有激活酶的作用，又有稳定酶的效果，是常规的步骤之一；（4）实验室操作用柱色谱比静态吸附效果好，而生产中因当然静态吸附有时效率较高，用什么方式应视具体生产情况而定。用离子交换色谱法制备高纯度酶，其特点是上样量较大，在纯化过程中流速较快，纯化中间体只需一步即可达到质量标准的要求，但该文未报道所用交换剂的型号。

3. 盐析与疏水色谱相结合工艺

将胰激肽原酶粗品溶于10%饱和度的硫酸铵溶液，离心取上清液，加入硫酸铵粉末使溶液达到35%饱和度，再离心取上清液，加入硫酸铵达70%饱和度，离心，沉淀溶解后进行疏水色谱。以Buty1SepharoseFF为介质；平衡缓冲液为10mmol/L Na2HPO4/NaH2PO4+1.0mol/L(NH4)2SO4（pH6.5）；洗脱缓冲液为10mmol/LNa2HPO4/NaH2PO4（pH6.5）。通过盐析和柱色谱可除去大部分杂质，得到比活大于500u/mg的胰激肽原酶，收率为85.6%。由于疏水色谱在较高盐浓度条件下操作，此工艺经过盐析后的上清液中盐浓度较高，70%硫酸铵盐析后的沉淀含有较多的盐，其溶解液不宜作离子交换色谱，但在溶解液中再加少许盐调整后可直接作为疏水色谱的进料。疏水色谱收集的非目标蛋白质洗脱液可作为分离其他酶如弹性酶，糜胰蛋白酶等的原料。

4. 联产工艺

胰激肽原酶、弹性酶和糜胰蛋白酶的联产工艺。以猪胰脏的丙酮脱水干燥粉为原料，用适当溶液提取，提取液中加CM-纤维素吸附，对吸附后CM-纤维素的洗脱液用丙酮沉淀，得糜胰蛋白酶。CM-纤维素吸附后的溶液中加DEAE-纤维素吸附，洗脱液用丙酮沉淀，得胰激肽原酶。猪胰脏丙酮脱水干燥粉经提取后的残渣，再用另一种溶液提取，提取液中加CM-纤维素吸附，洗脱液用丙酮沉淀，得弹性酶。

主要参考资料

[1] 胰激肽原酶治疗糖尿病综述

[2] 临床常用药物

[3] 胰激肽原酶的制备方法和质量控制