轮环藤碱的制备

发布日期:2020/10/18 17:56:53

背景及概述^[1]

轮环藤CyclearacemosaOliv．又名山豆根，为防己科轮环藤属植物，以根入药，有消炎止痛和清热解毒的作用，用于治疗腹痛、急性肠胃炎、风湿痛等症。轮环藤为中国特有种，主要分布于西南、华南地区，在四川省分布较广泛。已从四川崇州的轮环藤中分得轮环藤碱、异粒枝碱、海岛轮环藤碱和轮环藤新碱等四个双苄基异喹啉生物碱(BBI)。

轮环藤所含生物碱结构类型为较为独特的头尾连接的BBI，鉴于该类生物碱良好的药理作用，现较系统地分离研究了采自四川邻水华蓥山地区的轮环藤的生物碱成分。从轮环藤根中分离到了8个生物碱成分，运用光谱学方法鉴定为异粒枝碱(Ⅰ)、轮环藤碱(Ⅱ)、海岛轮环藤碱(Ⅲ)、海岛轮环藤酚碱(Ⅳ)、racemosinineB(Ⅴ)、木兰碱(Ⅵ)、α－cyclanoline(Ⅶ)和steponine(Ⅷ)。

相关研究^[2]

有研究考察了左旋箭毒碱、轮环藤碱、异粒枝碱三种双苄基异喹啉类生物碱（BBI）对脂多糖（LPS）诱导小鼠巨噬细胞系RAW264.7细胞过度活化的抑制作用及机制。首先，培养RAW264.7小鼠巨噬细胞，采用四甲基偶氮唑盐（MTT）法考察三种BBI（0.1-30μmol/L）单独或与LPS（1μg/ml）联合应用对巨噬细胞存活率的作用，以排除药物毒性作用造成的影响。

结果表明，三种生物碱对LPS活化的巨噬细胞存活率无显著影响。此外，三种生物碱单独作用亦不影响巨噬细胞的存活率。其次，考察左旋箭毒碱、轮环藤碱、异粒枝碱三种生物碱对巨噬细胞过度活化的抑制作用。采用Griess法检测三种BBI（0.1-30μmol/L）对LPS激活的巨噬细胞NO释放的抑制作用，并对三种BBI的活性作用进行比较。

结果表明，三种BBI均能在不同程度上抑制过度活化的巨噬细胞释放NO，而不影响细胞的基础NO释放量。通过对比半数抑制浓度（IC50）发现，左旋箭毒碱对NO释放的抑制作用最强，且作用效果均强于阳性对照粉防己碱（3μmol/L）。应用酶联免疫吸附分析实验（ELISA）检测3种BBI（0.1-10μmol/L）对LPS激活的巨噬细胞释放炎症因子（TNF-α、IL-1β和IL-6）的影响。

在3种BBI中，左旋箭毒碱对炎症因子释放的抑制作用较强。分别通过研究三种生物碱对巨噬细胞内一氧化氮合酶（iNOS）表达、游离钙离子水平的影响及对体外NO捕捉能力和多种自由基的清除能力，对三种生物碱抑制巨噬细胞过度活化的作用机制进行了研究。采用Western-blotting（免疫印迹）对三种生物碱抑制细胞内iNOS表达的研究结果证明，三种BBI（1-10μmol/L）可以显著抑制LPS激活巨噬细胞内诱导型iNOS蛋白的表达同时，采用Fluo-3/AM染色法以流式细胞仪对三种BBI（10μmol/L）作用于LPS活化的巨噬细胞后胞浆游离钙离子浓度([Ca²⁺]_i)的变化测定结果表明，三种BBI可显著抑制LPS诱导的巨噬细胞内[Ca²⁺]_i水平异常升高.

为考察三种BBI（0.1-30μmol/L）对活性氮成分的捕捉能力，以硝普钠（SNP）为NO供体，检测其对NO直接清除的能力。实验结果表明，三种BBI均能够使SNP溶液中NO2-含量显著降低，证明三种BBI具有直接清除NO的能力。

为进一步考察三种BBI对巨噬细胞活化的抑制作用是否与其抗氧化抗自由基作用相关，本研究采用紫外分光光度法检测三种BBI（0.1-30μmol/L）对DPPH的清除作用，水杨酸法考察对羟自由基（·OH）清除作用，L-酪氨酸法检测其对过氧亚硝酸根离子自由基（ONOO-）清除作用，邻苯三酚自氧化法检测其对超氧阴离子自由基（·O2-）清除作用。结果表明，三种BBI对DPPH、·OH、ONOO-和·O2-自由基均有显著清除作用。

综上所述，三种BBI（左旋箭毒碱、轮环藤碱、异粒枝碱）可通过抑制过度活化的巨噬细胞内iNOS表达而抑制LPS诱导的巨噬细胞NO释放，同时还可以抑制活化的巨噬细胞释放炎症因子IL-1β、TNF-α、IL-6，且不影响细胞的存活率。

上述抑制作用可能与其抑制细胞内[Ca²⁺]_i的增高，及直接清除NO和DPPH、·OH、ONOO-、·O2-自由基的抗氧化作用有关。三种生物碱抑制LPS诱导的巨噬细胞活化作用及对多种自由基的清除作用均强于阳性对照药粉防己碱。且综合考量，三种生物碱中左旋箭毒碱作用效果。左旋箭毒碱、轮环藤碱、异粒枝碱可能对巨噬细胞过度激活引起的外周炎症相关疾病具有一定的防治作用。

制备^[1]

取轮环藤根粗粉10．5kg，95%乙醇浸提(8倍量×3)，乙醇液浓缩得粗提物，将其加入到1．0L水中，用2mol·L－1盐酸调pH3。酸水层用乙酸乙酯萃取(2L×2)，进一步用氨水调pH10，并用氯仿萃取浓缩得总碱A(48g)，用氯仿－甲醇(8∶2)萃取浓缩总碱B(11g)。48g总生物碱A，以氯仿溶解，经硅胶柱层析氯仿－甲醇梯度洗脱，分段收集得F1～F4四个部分。F2(21．0g)经反复硅胶柱层析，得到单体化合物Ⅰ(2．9g)、轮环藤碱(19mg)、Ⅲ(400mg)和Ⅳ(120mg)。F3(3．3g)经硅胶柱层析得化合物Ⅴ(16mg)。11g总生物碱B，甲醇溶解，经反复硅胶柱层析，得单体化合物Ⅵ(1．1g)、Ⅶ(50mg)和Ⅷ(36mg)。