三氯苯达唑可间接诱导乳腺癌细胞焦亡

一、研究背景

乳腺癌是女性中最常见的癌症，在与癌症相关的女性死亡病例中，乳腺癌造成的死亡人数最多(约15%)，虽然化疗是治疗多种癌症的主要策略，但化疗耐药使乳腺癌患者化疗的总体有效率仍不高，这种耐药的一个主要机制是抗凋亡系统的激活，使癌细胞逃避药物诱导的凋亡，所以急需引入可触发非凋亡PCD的新型药物。三氯苯达唑20多年来一直用于治疗家畜肝吸虫感染，并成功地用于治疗人类吸虫病，目前尚无关于其抗癌作用及可能机制的研究报道。在本研究中，以表达GSDME蛋白的乳腺癌MCF-7和MDA-MB-231细胞株为细胞模型，通过激活caspase-3诱导GSDME依赖性焦亡来探讨三氯苯达唑对肿瘤的作用。

二、结果分析

1、三氯苯达唑通过降低线粒体膜电位诱导乳腺癌细胞焦亡

CCK-8结果显示160μM三氯苯达唑能显著降低乳腺癌细胞的细胞活性，V-FITC/PI染色后检测到细胞双阳性比例上升，PI单阳性细胞比例上升，且经药物处理后细胞呈圆形、肿胀，胞质膜外有明显的大泡延伸，以上指标表明三氯苯达唑可诱导乳腺癌细胞发生焦亡。作者进一步探讨三氯苯达唑是否通过干扰线粒体功能而诱导乳腺癌细胞焦亡，结果发现该药物显著降低了JC-1聚集物(红色)与单体(绿色)的比例，表明这两种细胞在三氯苯达唑治疗后膜电位降低。

2、凋亡通路介导三氯苯达唑诱导乳腺癌细胞焦亡

为进一步研究三氯苯达唑诱导乳腺癌细胞焦亡的机制，作者检测了凋亡的蛋白标记物，包括Bax、Bcl-2、cleaved-caspase-9、cleaved-caspase-8、cleaved-caspase-3、cleaved caspase-7和cleaved-PARP，结果显示Bax的表达上调，Bcl-2表达下调，凋亡启动因子caspase-8和caspase-9在三氯苯达唑处理的细胞中以剂量依赖的方式被激活和切割，下游caspase-3、caspase-7也被激活，PARP被裂解激活。上述结果表明，细胞凋亡的内在途径和外在途径均被启动，最终焦亡执行蛋白GSDME在caspase-3的剪切下活化，于细胞膜上寡聚打孔。

3、Cleaved-Caspase-3是三氯苯达唑诱导乳腺癌细胞焦亡的关键开关

因为cleaved caspase-3是将GSDME加工成N-GSDME (37KD)片段的关键酶，作者接下来探讨了阻断caspase-3的激活是否会减弱三氯苯达唑诱导的细胞死亡，在使用caspase-3的特异性抑制剂DEVD后，三氯苯达唑诱导的乳腺癌细胞死亡率下降，cleaved-caspase-3 (17/19 kDa), cleaved-GSDME (37 kDa), and cleaved-PARP (89 kDa) 表达均下调。这些结果表明，caspase-3介导的GSDME切割参与了三氯苯达唑诱导的细胞焦亡，并且N-GSDME水平与焦亡水平相关。

4、三氯苯达唑诱导的GSDME依赖性焦亡是ROS/JNK/ bax 线粒体凋亡通路的下游

经三氯苯达唑处理后，MCF-7和MDA-MB- 231细胞株中ROS水平均上调，JNK的磷酸化显著增加，但没有改变JNK的组成性表达。在使用ROS清除剂NAC预处理后，NAC显著抑制三氯苯达唑诱导的ROS升高，且NAC预处理可部分拮抗三氯苯达唑对Bax、Bcl-2表达和JNK磷酸化水平的影响，且提升了细胞存活率和线粒体膜电位，抑制了caspase-3、caspase-9、PARP、GSDME的裂解活化。这些结果表明，三氯苯达唑至少部分通过增强ROS/JNK/ bax 线粒体凋亡通路诱导焦亡。

5、三氯苯达唑诱导乳腺癌肿瘤移植物发生焦亡

将MDA-MB-231乳腺癌细胞植入BALB/C裸鼠右侧翼皮下，并注射三氯苯达唑溶液，发现与对照组相比，三氯苯达唑显著降低了肿瘤移植物的体积，cleaved-caspase-3，cleaved-PARP，N-GSDME表达上调，该结果与体外实验结果一致，表明三氯苯达唑在体内可诱导乳腺癌细胞发生焦亡。