复合蛋白酶的应用

背景^[1-3]

复合蛋白酶是多种蛋白酶的混合物，主要是由蛋白水解酶等组成。

催化蛋白质水解的酶类。种类很多，重要的有胃蛋白酶、胰蛋白酶、组织蛋白酶、木瓜蛋白酶和枯草杆菌蛋白酶等。蛋白酶对所作用的反应底物有严格的选择性，一种蛋白酶仅能作用于蛋白质分子中一定的肽键，如胰蛋白酶催化水解碱性氨基酸所形成的肽键。蛋白酶分布广，主要存在于人和动物消化道中，在植物和微生物中含量丰富。由于动植物资源有限，工业上生产蛋白酶制剂主要利用枯草杆菌、栖土曲霉等微生物发酵制备。

复合蛋白酶

复合蛋白酶也可以由枯草杆菌(Bsubtilis)深层液体发酵产生,经浓缩提取精制复合而成。复合蛋白酶是为水解蛋白质而研制的杆菌蛋白酶复合体。复合蛋白酶主酶是碱性蛋白酶，酶活力根据主酶活力定义。酶处理温度40～50℃，处理50分钟，用蒸馏水浸泡13小时，其中沉淀物是载体。与许多其它内切蛋白酶不同，Protamex即使在低水解度的情况下也能产出没有苦味的蛋白水解液。适用动物蛋白、动物血液的水解。

蛋白酶是水解蛋白质肽链的一类酶的总称。按其降解多肽的方式分成内肽酶和端肽酶两类。前者可把大分子量的多肽链从中间切断，形成分子量较小的朊和胨；后者又可分为羧肽酶和氨肽酶，它们分别从多肽的游离羧基末端或游离氨基末端逐一将肽链水解生成氨基酸。

顾名思义复合蛋白酶也属于一种酶，它能分解多种蛋白质，可以起到催化的作用，由于这种物质的特性，决定着它具有独特的功效和用途。

催化的化学反应也叫酶活性。酶活力可受多种因素的调节控制，从而使生物体能适应外界条件的变化，维持生命活动。没有酶的参与，新陈代谢几乎不能完成，生命活动就根本无法维持。

应用^[4][5]

复合蛋白酶可以用于稻曲菌枯草杆菌蛋白酶家族基因功能研究

研究稻曲菌的致病机理对明确病菌的侵染特性和培育抗病品种具有重要的理论意义和应用价值。

研究对稻曲菌枯草杆菌蛋白酶家族8个基因的基因功能进行了初步探索,选择其中的Uv8b＿1567基因深入探究其致病机理。

研究结果如下:(1)对稻曲菌枯草杆菌蛋白酶家族Uv8b＿44、Uv8b＿1567、Uv8b＿4545、Uv8b＿6002、Uv8b＿6469、Uv8b＿7084、Uv8b＿7700和Uv8b＿8155基因编码的蛋白质结构域进行预测和分析,发现所有蛋白含有一个共同的Peptidase S8结构域,其中Uv8b＿44、Uv8b＿1567和Uv8b＿8155基因编码的蛋白含有Inhibitor I9结构域,Uv8b＿6469和Uv8b＿7700基因编码的蛋白含有Fn-III结构域,除了Uv8b＿4545和Uv8b＿7084基因编码的蛋白质没有信号肽之外,其余蛋白全部包含一个信号肽。对这8个基因进行敲除和互补,发现Uv8b＿44、Uv8b＿1567和Uv8b＿8155基因缺失后,菌丝生长速率显著降低,对压力胁迫的敏感性也明显改变。Uv8b＿1567和Uv8b＿8155基因敲除转化子产孢量显著升高,Uv8b＿44和Uv8b＿1567基因敲除转化子致病力显著下降,Uv8b＿8155基因敲除转化子致病力完全丧失。

(2)进一步对Uv8b＿1567(UvPr1a)基因的致病机理进行研究,发现UvPr1a蛋白包含一个信号肽(SP),酵母分泌活性试验证明其信号肽具有分泌活性。UvPr1a亚细胞定位于烟草细胞的细胞质。大量表达UvPr1a能够抑制Bax诱导的细胞过敏性坏死,UvPr1a异源超表达转基因水稻对稻曲病、稻瘟病和白叶枯病抗性显著减弱,表明效应子UvPr1a可以抑制植物的免疫反应。使用酵母双杂交从水稻文库中筛选到互作的抗病蛋白OsSGT1,进一步使用酵母双杂交、Co-IP、BiFC以及GST pull-down证明UvPr1a和OsSGT1在细胞质互作。OsSGT1基因敲除后,对稻曲病、稻瘟病和白叶枯病的抗性显著减弱,OsSGT1基因超表达后,对稻曲病、稻瘟病和白叶枯病的抗性显著增强,表明OsSGT1广谱正调控水稻的抗病性。将UvPr1a和OsSGT1在烟草细胞中共表达,发现UvPr1a抑制OsSGT1诱发的过敏性坏死反应。将UvPr1a和OsSGT1蛋白进行原核纯化后体外共孵育试验表明UvPr1a蛋白能直接降解OsSGT1蛋白。

参考文献

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[5]李夏冰.稻曲菌枯草杆菌蛋白酶家族基因功能研究[D].华中农业大学,2022.