人正常前列腺上皮细胞的应用

背景^[1-3]

人正常前列腺上皮细胞来自一位54岁白人男性的正常前列腺组织切片的周围区域的上皮细胞用单拷贝的人乳头瘤病毒18（HPV-18）进行转化，建立了RWPE-1。RWPE-1细胞在三维Matrigel培养时，在雄激素刺激下，形成腺胞（acini）并向培养基中分泌PSA。当与Matrigel或基质细胞混合注射雄性裸鼠时，RWPE-1细胞也能形成腺胞并产生PSA。来源于RWPE-1的细胞用Kirstin鼠肉瘤病毒（Ki-MuSV）转染Ki-ras基因，建立了能成瘤的RWPE-2细胞和RWPE2-W99细胞。

培养条件培养基：K-SFM+0.05 mg/ml BPE+5 ng/ml EGF；温度：37℃气相：95%空气，5%二氧化碳。

人正常前列腺上皮细胞

细胞传代：

1.用75%酒精喷洒整个培养瓶消毒，将其平躺置于培养箱中进行1-3小时的缓冲，然后置于无菌操作台，打开瓶口，将其中的培养液去掉，再往其中加入5-6mL新鲜培养基并置于细胞培养箱中培养，根据细胞生长状况及培养基颜色变化对其进行换液以及传代；

2.待细胞长满瓶底面积80%-90%，需要对其进行传代，次传代比例为1:2；

3传代步骤：将0.25%含EDTA胰酶置于37°预热，倒掉培养瓶中的培养基，往培养瓶中加入3-5 ml PBS，轻晃洗涤后弃去。往瓶中加1-2 ml预热好的胰酶，置于37°孵育消化（次消化需时常取出置于显微镜下观察，以显微镜下细胞触角回收变圆、轻拍瓶壁见细胞脱落为消化时间，记录消化时间，以便于下次消化），消化好后加入1m含有2%FBS的D-PBS终止消化。用移液枪轻轻吹打瓶壁上的细胞，使之完全脱落，然后收集细胞悬液，1200rpm离心3min，弃上清，加入完全培养基重悬细胞，进行传代。

应用^[4][5]

用于阴离子通道CFTR在双酚A致前列腺细胞恶性转化的潜在作用研究

在探究CFTR在BPA对人正常前列腺细胞的影响中的潜在机制。

本研究有助于揭示环境内分泌干扰物的致生殖系统相关肿瘤的机制,促进开发防癌治癌的药物或技术。

方法:首先通过CCK-8确定BPA对人正常前列腺上皮细胞的染毒浓度及时间;在适当浓度和时间的BPA作用下,通过划痕实验、软琼脂克隆实验及Transwell小室实验测定前列腺上皮细胞的增殖、迁移及侵袭力;用ELISA法和Western Blotting蛋白印迹法分别检测BPA处理后的前列腺细胞的ATP及CFTR、Bcl-2、Bax的含量;用流式细胞仪检测BPA作用后的各组细胞的凋亡水平。利用SPSS通过单因素方差分析及析因设计方法分析数据,定量数据用平均值±标准差表示,p<0.05为差异有统计学意义。

结果:CCK-8的结果显示,RWEP-1细胞的活性与BPA的浓度呈非线性关系。在0μM-10μM浓度范围内,BPA作用24 h后,细胞活性无明显变化。当浓度大于10μM时,细胞活性明显下降。经绘制生长曲线后计算出IC50为160μM。毒理学上通常取毒物IC50的八分之一作为染毒浓度,因此在本研究中BPA的最适染毒浓度为20μM。在最适BPA浓度下RWPE-1细胞细胞活性与时间无明显关联。20μM BPA染毒48 h后细胞的凋亡水平无明显差异。

以上实验说明20μM此浓度对细胞无急性损伤作用且不会改变其凋亡水平,浓度合适。在最适浓度BPA染毒4周后得到染毒细胞株。与对照组相比,软琼脂克隆实验、划痕实验及Transwell小室实验发现染毒之后的细胞克隆能力、迁移能力及侵袭能力,其各项能力均显著增强。染毒后细胞内ATP水平明显降低;BPA染毒后的人正常前列腺上皮细胞内CFTR和Bax水平显著降低,而Bcl-2蛋白表达水平明显增加。

结论:（1）BPA能诱导人正常前列腺上皮细胞发生恶性转化。（2）BPA可能通过抑制阴离子通道CFTR的表达致线粒体功能障碍并抑制细胞凋亡而诱导人正常前列腺上皮细胞恶性转化。

参考文献

[1]Perinatal exposure to Bisphenol A disturbs the early differentiation of male germ cells[J].Pagotto Romina,Santamaría Clarisa G.,Belén Harreguy María,Abud Julián,Zenclussen María Laura,Kass Laura,Crispo Martina,Mu?oz de Toro Mónica M.,Rodriguez Horacio A.,Bollati Fogolín Mariela.Reproductive Toxicology.2020(prep)

[2]Multigenerational and transgenerational impact of paternal bisphenol A exposure on male fertility in a mouse model.[J].Rahman Md Saidur,Pang Won-Ki,Ryu Do-Yeal,Park Yoo-Jin,Pang Myung-Geol.Human reproduction（Oxford,England）.2020(8)

[3]Efficiency of selected wastewater treatment processes in removing estrogen compounds and reducing estrogenic activity using the T47D-KBLUC reporter gene assay[J].Muyasu Grace Kibambe,Maggie N.B.Momba,A.P.Daso,M.C.Van Zijl,Marthie A.A.Coetzee.Journal of Environmental Management.2020(C)

[4]Cancer statistics,2020.[J].Siegel Rebecca L,Miller Kimberly D,Jemal Ahmedin.CA:a cancer journal for clinicians.2020(1)

[5]刘佳.阴离子通道CFTR在双酚A致前列腺细胞恶性转化的潜在作用研究[D].桂林医学院,2021.