LSD1-IN-1的应用

背景及概述^[1][2]

人赖氨酸特异性去甲基化酶(Human lysine specific demethylase l，LSD1)是 胺氧化酶家族成员之一，在黄素腺嘌呤二核苷酸(Flavin adenine dinucleotide，FAD)的参与下，LSD1特异性地去除组蛋白H3上第四位(H3K4)和第九位(H3K9)赖氨酸残基上的二甲基和一甲基修饰。此外，LSD1还能去除其它一些非组蛋白底物上的甲基化修饰，例如p53、DNMT1和E2F1等。LSD1在多种肿瘤中高表达，包括前列腺癌、未分化的成神经细胞瘤、雌激素阴性的乳腺癌、膀胱癌和结直肠癌等。

LSD1高表达与基底样乳腺癌细胞差的预后相关，且对聚腺苷二磷酸-核糖聚合酶(PARP)抑制剂具有敏感性。同时我们实验也发现，过表达LSD1能够增强促进三阴性乳腺癌细胞生长和促进DNA双链断裂修复。因此，LSD1成为肿 瘤等疾病的重要的、潜在的药物作用靶标。因此，利用选择性强、高效、低毒的去甲基化酶抑制剂来抑制LSD1功能是治疗肿瘤的一种新途径。

目前LSD1的抑制剂主要有反苯环丙胺类抑制剂、底物多肽类似物和多胺类 LSD1小分子抑制剂等。由于LSD1属于胺氧化酶家族，因此胺氧化酶的抑制剂被首先用来考 察是否抑制LSD1。最早发现的LSD1抑制剂为反苯环丙胺又名强内心百乐明，TCP在临床上被用来治疗抑郁症，它能够抑制LSD1活性，但是其对胺氧化酶家族的选择性较差。

由ORYZON Genomics S.A.公司开发的高度选择 性、强劲的LSD1抑制剂ORY-1001，其IC50<20nM，结合LSD1能力是TCP的100倍，它 是一个LSD1选择性抑制剂，对其它依赖FAD的氧化酶类(MAO-A/B,IL4I1,KDM1B>100μM,SMOX 7μM)没有显著的抑制活性。用该化合物处理急性髓性白血病中的THP-1细胞，能够剂量依赖 的促进THP-1细胞分化，并进一步促进细胞调亡。ORY-1001能够抑制急性慢性白血病MV(4；11)细胞的增殖和克隆形成，还能显著地抑制接种MV(4；11)小鼠模型的肿瘤生长。

应用^[2]

2014年，欧洲药品管理局(European Medicines Agency，EMA)批准了个LSD1 特异型抑制剂ORY-1001进行I/II A期临床试验，用于治疗急性髓系白血病(AML。药物抑制LSD1后会影响细胞多个基因的表达，使得白血病母细胞转变为正常分化细胞，同时也 降低了白血病干细胞的增殖和存活能力。REL-N1-[(1R,2S)-2-苯基环丙基]-1,4-环己二胺二盐酸盐(ORY-1001) 1001能够显著地降低急性淋巴白血病(ALL)小鼠模型中肿瘤细胞的负荷和延长小鼠的存活时间。

三阴性乳腺癌(triplenegativebreastcancer,TNBC)为雌激素受体(estrogenreceptor,ER)、孕激素受体(erogesteronereceptor,PR)和人表皮生长因子受体2(HER-2)均阴性表达的乳腺癌，约占乳腺癌的10％-22％，被认为是一种独立的临床病理类型，具有侵袭性强、预后差和缺乏特异性治疗方法等特点。

鉴于以上ORY-1001对白血病细胞强的抑制作用，认为有必要在三阴性乳腺癌细胞系中系统研究ORY-1001对放射治疗和联合紫杉醇化疗在临床前的作用，为以后开展该药物对三阴性乳腺癌临床应用提供临床前的相关实验基础和技术指导。

结构^[1，3]

制备 ^[1]

反式-N1-[(1R,2S)-2-苯基环丙基]-1,4-环己二胺二盐酸盐的合成如下：

步骤1 ：将乙酸（586mg，9.77mmol）加入到反式-2-苯基环丙胺（1.3g，9.77mmol）和4-氧代环己基氨基甲酸叔丁酯（2.08g，9.77mmol）的DCE（26mL）溶液中并搅拌5分钟。然后在0℃下加入三乙酰氧基硼氢化钠（3.72g，17.5mmol）并在室温下搅拌5小时。完成后，将反应混合物用DCM（50mL），水（50mL），盐水（50mL）稀释，经无水Na 2 SO 4干燥，过滤并蒸发。使用SiO 2通过柱色谱法纯化粗残余物，通过洗脱EtOAc：石油醚（1：9），得到4-（反式-2-苯基环丙基氨基）环己基氨基甲酸叔丁酯（2.5g，77.6％），为淡黄色液体。

第2步：在15℃下，将1,4-二恶烷（10mL）加入到4-（反式-2-苯基环丙基氨基）环己基氨基甲酸叔丁酯（2.45g，7.57mmol）的二恶烷（25mL）溶液中，并在室温下搅拌16小时完成后，蒸发溶剂并将残余物用Et 2 O研磨并干燥，得到（反式）- N1-（2-苯基环丙基）-1,4-环己二胺二盐酸盐（1.5g，67.5％），为灰白色固体。

上面得到的N1-（（反式-2-苯基环丙基）环己烷-1,4-二胺（反式）- N1-（2-苯基环丙基）-1,4-环己二胺二盐酸盐是4种异构体的混合物，它们对应于环丙基环的两种不同（反式）构象的组合（它们是（1R， 2S）和（1S，2R），分别具有关于环己烷环的CIS和TRANS构象。其中反式-N1-[(1R,2S)-2-苯基环丙基]-1,4-环己二胺二盐酸盐如下：

步骤1：在0℃下，向反式-2-苯基环丙胺（0.8g，6.01mmol）在EtOH（5.4mL）中的溶液中加入L（+）酒石酸（0.90g，6.01mmol），在0℃下并在室温下搅拌1小时。完成后，过滤固体并干燥，得到反式-2-苯基环丙胺，为酒石酸盐（1.5g，88.2％）。在IPA中加入盐：水（3：1）（15mL）并在70℃下搅拌2小时。亲爱的解决方案允许冷却至室温。通过过滤收集分离的固体，在水（50mL）中取出，用NaOH溶液碱化，并用EtOAc（2×50mL）萃取。将合并的萃取液用水（50mL），盐水（50mL）洗涤，经无水Na2SO 4干燥，过滤并蒸发，得到（1R，2S）-2-苯基环丙胺（320mg）。

步骤2：在DCE中的（1R，2S）-2-苯基环丙胺（280mg，1.21mmol），4-氧代环己基氨基甲酸叔丁酯（309mg，1.45mmol）和乙酸（72mg，1.21mmol）的溶液（在0℃下，加入8mL），加入三乙酰氧基硼氢化钠（461mg，2.17mmol）并在室温下搅拌3小时。完成后，蒸发溶剂，将粗残余物溶于水（25mL）中，用NaHCO3处理，并用EtOAc（2×25mL）萃取。

将合并的萃取液用水（25mL），盐水（25mL）洗涤，经无水Na2SO 4干燥，过滤并用水洗涤蒸发。使用SiO 2通过柱色谱法纯化粗产物，用EtOAc：石油醚（3：7）洗脱，得到（（顺式）-4  - （（（1R，2S）-2-苯基环丙基）氨基）环己基氨基甲酸叔丁酯。 （180mg，25.35％）和（反式）-4-（（（1R，2S）-2-苯基环丙基）氨基）环己基）氨基甲酸叔丁酯（210mg，29.5％）。

步骤3：在10℃下，（（反式）-4-（（（1R，2S）-2-苯基环丙基）氨基）环己基）氨基甲酸叔丁酯（160mg，0.48mmol）在1,4-二恶烷（2mL）中的溶液0℃逐滴加入HCl的1,4-二恶烷（2mL）溶液，并在室温下搅拌16小时。蒸馏后，蒸发溶剂，将固体与Et2O一起搅拌，过滤并干燥，得反式-N1-[(1R,2S)-2-苯基环丙基]-1,4-环己二胺二盐酸盐（95mg，50.8％），为白色固体。

主要参考资料

[1] WO2013057322. (HETERO)ARYL CYCLOPROPYLAMINE COMPOUNDS AS LSD1 INHIBITORS

[2] CN201510677129.0 ORY-1001联合放疗和化疗用于治疗人三阴性乳腺癌的用途