小鼠肝细胞的应用

背景^[1-3]

小鼠肝细胞是从对人TGFα进行转基因的小鼠（CD1株，MT42系）的肝细胞中建立的贴壁上皮样细胞。

通过电子显微镜，这些细胞表现出典型的肝细胞特征，例如过氧化物酶体和胆小管样结构。AML12细胞保留表达血清（白蛋白，α1抗胰蛋白酶和转铁蛋白）和间隙连接（连接蛋白26和32）蛋白的高水平mRNA的能力，并且仅包含乳酸脱氢酶的同工酶5。细胞表达高水平的人TGFα和较低水平的小鼠TGFα。肝特异性蛋白的表达随培养时间的延长而降低，但会通过在无血清培养基中生长细胞而重新激活。

小鼠正常肝细胞系作为一个生物医学领域常用的细胞实验模型，经常为广大科研工作者所接触。细胞的培养在实验中起到根基作用，如何争取的培养与使用，则是应用实操的关键。

肝细胞为多角形，直径约为20-30/加（微米），有6-8个面，不同的生理条件下大小有差异，如饥饿时肝细胞体积变大。

每个肝细胞表面可分为窦状隙面、肝细胞面和胆小管面三种。肝细胞里面含许许多多复杂的细微结构：如细胞核、细胞质、线粒体、内质网、溶酶体、高尔基体、微粒体及饮液泡等组成。

小鼠肝细胞

小鼠肝细胞制备步骤：

1.断头处死成年小鼠，充分放血后迅速无菌取出肝脏组织，置于缓冲液中；

2.首先将肝组织剪成5mm边长的组织块，使用缓冲液洗涤2-3遍，然后进一步将肝组织剪碎成1mm3的组织小块，使用缓冲液冲洗直至上清澄清；

3.组织块转移至50ml离心管内，加入10ml消化液，37%，静置消化1h，间隔15min摇动1次；

4.消化完全后使用巴氏滴管反复吹打消化产物30次，消化物分别过80目、200目细胞筛，收集滤液；

5.1000rpm，室温离心8min，收集细胞，使用基础培养基重悬细胞；

6.600rpm，离心5min，重复离心纯化2次，细胞经台盼蓝染色，计数，按1x106/25cm2的细胞数分瓶，使用完全培养基+20%FBS进行培养。

7.18h后换液，以后每天换液。

应用^[4][5]

用于载铅超细炭黑对CAT、SOD及小鼠肝细胞毒性效应与机理的研究

选取小鼠原代肝细胞为靶细胞,选取CAT和SOD为靶蛋白,选取UFCB作为UFPs的生物替代模型,在细胞水平和分子水平研究比对了UFCB和载铅UFCB诱发机体氧化应激的效应与机理。

主要包括以下几部分内容:（1）综述了大气颗粒物、UFPs、UFCB和铅的污染现状及现阶段毒理学研究进展,明确了现阶段对载铅UFPs毒性机理评价的不足,确定了本次的研究目的和研究内容。

（2）利用多种方法对UFCB进行改性修饰,改性后超细炭黑（MCB）水溶液的Zeta电位为-39.7 mV,远高于改性之前的-18.2 mV,证明MCB的分散稳定性优于改性之前。将MCB应用于铅的吸附实验,最后得到铅含量为0.235 g/g的载铅MCB（即Pb-MCB）。

（3）研究比对了MCB和Pb-MCB诱发小鼠肝细胞氧化应激效应的影响。实验结果表明:肝细胞活力与MCB和Pb-MCB暴露浓度之间均呈负活力-剂量关系。细胞内MDA含量随MCB和Pb-MCB暴露浓度的增加而升高,且在50 mg/L时达到最高,分别为对照组的204.44%和172.49%,高浓度的MDA打破了细胞内部的氧化还原平衡并破坏了细胞膜的完整性,使细胞发生脂质过氧化作用从而导致细胞活力降低甚至死亡。随着MCB和Pb-MCB暴露浓度的升高,细胞内CAT的相对活力均呈先上升后下降的趋势。MCB的暴露同样导致了胞内SOD的相对活性先上升后下降,但是随Pb-MCB暴露浓度的增加,SOD的相对活性逐步上升。比对同等暴露条件下MCB和Pb-MCB对小鼠肝细胞氧化应激指标的影响发现,MCB的细胞毒性较Pb-MCB的细胞毒性强,原因是MCB较Pb-MCB带更多的负电荷,更易与膜蛋白、CAT和SOD结合作用,影响细胞和酶的活力及功能表达。

（4）利用多种光谱学手段研究比对了MCB和Pb-MCB的暴露对CAT和SOD分子结构和功能的影响。结果发现:无论是MCB还是Pb-MCB都会与CAT和SOD结合,在炭黑颗粒表面形成一层“蛋白冠”类的物质,改变了CAT和SOD发色团的微环境,使蛋白质骨架结构紧缩,疏水性增强。MCB和Pb-MCB暴露染毒均使CAT的活性先上升后下降,使SOD的活性持续下降。CAT和SOD活性的变化一方面说明了结构的改变影响了酶的功能表达;另一方面酶与MCB或Pb-MCB的结合会影响其活性位点附近氨基酸的微环境,从而间接对酶的活性产生影响或者抑制作用。

比对同等暴露条件下MCB和Pb-MCB对CAT和SOD分子的影响时发现,MCB对CAT和SOD结构和功能的影响大于Pb-MCB对两种酶蛋白的影响,原因是MCB带大量的负电荷,更易与带正电荷的CAT或者SOD结合作用,改变酶蛋白的结构使其活性降低;而Pb-MCB溶液中微量Pb2+的存在促进了Pb-MCB粒子的团聚沉降,粒径的增大使Pb-MCB与酶蛋白之间的作用力和结合面积减小,因此MCB较Pb-MCB表现出更强的分子毒性。

参考文献

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[5]贾晨号.载铅超细炭黑对CAT、SOD及小鼠肝细胞毒性效应与机理的研究[D].山东大学,2019.