HUH-7细胞专用培养基的应用

背景^[1-3]

HUH-7细胞专用培养基可保持HuH-7细胞的生长状态。本产品中已包含HuH-7细胞生长所需的各种成分，无需添加任何成分，可直接用于HuH-7细胞的体外培养。HuH-7细胞分离自人肝癌组织可产甲胎蛋白、胰酶α抗体、血浆铜蓝蛋白、纤维蛋白原、纤维粘连蛋白等。

HUH-7细胞专用培养基

培养步骤

1）复苏细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入5mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心5分钟，弃去上清液，补加4-6mL完全培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入6cm皿中），培养过夜。第二天换液并检查细胞密度。

2）细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

1、弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

2、加1-2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2min，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加5ml以上含10%血清的完全培养基终止消化。

3、轻轻吹打细胞，完全脱落后吸出，在1000RPM条件下离心8-10分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。

4、按5-6ml/瓶补加培养液，将细胞悬液按1：2到1：5的比例分到新的含5-6 ml培养液的新皿中或者瓶中。

应用^[4][5]

用于STYK1/NOK对HepG2及Huh-7细胞凋亡、增殖及细胞周期的影响研究

研究STYK1/NOK基因在肝癌细胞系HepG2（肝母细胞瘤来源）和Huh-7（肝细胞肝癌来源）中的作用并明确其作用机制。探讨过表达STYK1/NOK对HepG2细胞凋亡、细胞增殖的影响,反向验证,抑制STYK1/NOK蛋白表达对HepG2细胞凋亡、增殖及细胞周期的影响。随后,在Huh-7细胞中验证,明确STYK1/NOK对肝癌细胞系细胞增殖的影响,以期揭悉STYK1/NOK影响肝癌细胞增殖的具体作用机制。

方法:在HepG2细胞中过表达STYK1/NOK,通过western blotting检测蛋白表达情况,确定STYK1/NOK过表达。使用Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒检测分别转染0,2,6μg STYK1/NOK质粒的HepG2细胞的凋亡情况,每组重复3组,根据检测结果制作柱形图。

转染0,2,6μg STYK1/NOK质粒,48小时后,应用CCK8细胞增殖实验检测过表达STYK1/NOK对HepG2细胞增殖的影响,每组重复三组,随后应用OD值制作柱形图。为了明确检测结果,应用siRNA抑制HepG2细胞STYK1/NOK蛋白表达后行细胞增殖、细胞凋亡及细胞周期实验,并采用western blotting检测凋亡相关蛋白caspase 3,cleaved-caspase3及凋亡周期蛋白CDC25A,CDK2蛋白的表达情况,明确STYK1/NOK对HepG2细胞凋亡及细胞周期的影响。

并进一步明确具体作用机制。随后,相关实验在另一株肝癌细胞系Huh-7细胞中进行验证。过表达STYK1/NOK及通过应用siRNA抑制Huh-7细胞STYK1/NOK蛋白表达后,行细胞凋亡实验,并应用western bloting检测抑制STYK1/NOK细胞凋亡相关蛋白caspase 3及cleaved-caspase 3的表达情况,再进一步检测抑制STYK1/NOK蛋白表达后的细胞周期分布情况。

结果:在转染48h后,收集细胞,提取蛋白,行western blotting检测,检测结果表明STYK1/NOK的表达与转染的质粒浓度相关,呈剂量依赖效应。使用Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒检测过表达后HepG2细胞凋亡情况,结果发现在转染0,2,6μg STYK1/NOK质粒组,细胞凋亡百分比逐渐减少,分别为21.1%,19.7%,16.3%,重复三组,应用t检验统计,具有统计学意义（P<0.05）,表明转染STYK1/NOK抑制了HepG2细胞的凋亡。应用CCK8细胞增殖实验进行检测,研究过表达STYK1/NOK基因对细胞增值的影响。

在转染48 h后,加入CCK8试剂,2 h后进行检测,结果发现过表达STYK1/NOK促进HepG2细胞增殖。为了进一步验证实验结果,应用siRNA抑制HepG2细胞STYK1/NOK蛋白表达,再次行细胞凋亡实验,实验结果表明抑制STYK1/NOK蛋白表达促进细胞凋亡,分别转染0,2,6μg si-STYK1/NOK质粒,凋亡率分别为30.2%,30.6%,36.5%。

每组重复三组,行t检验,发现转染0μg si-STYK1/NOK质粒组和转染6μg si-STYK1/NOK质粒组凋亡率差异具有统计学意义（P<0.05）。细胞增殖实验结果表明,抑制STYK1/NOK抑制HepG2细胞增殖（P<0.01）。Western blotting结果表明抑制STYK1/NOK蛋白表达后,caspase 3蛋白表达减少,cleaved-caspase 3蛋白表达增加,表明抑制STYK1/NOK裂解活化了caspase3,促进HepG2细胞凋亡。

细胞周期结果表明,抑制STYK1/NOK蛋白表达后,S期细胞增多,G0/G1、G2/M期细胞减少,Western blotting结果表明抑制STYK1/NOK蛋白表达后,CDC25A蛋白和CDK2蛋白表达下调,表明抑制STYK1/NOK将HepG2细胞阻滞在S期,从而抑制细胞增殖。随后,检测结果在Huh-7细胞中进行验证,细胞凋亡实验、细胞周期实验结果均与HepG2结果相符。抑制Huh-7细胞STYK1/NOK蛋白表达后,通过裂解活化caspase 3促进细胞凋亡。

参考文献

[1]Annual report to the nation on the status of cancer,part II:Progress toward Healthy People 2020 objectives for 4 common cancers.[J].Henley S Jane,Thomas Cheryll C,Lewis Denise Riedel,Ward Elizabeth M,Islami Farhad,Wu Manxia,Weir Hannah K,Scott Susan,Sherman Recinda L,Ma Jiemin,Kohler Betsy A,Cronin Kathleen,Jemal Ahmedin,Benard Vicki B,Richardson Lisa C.Cancer.2020(10)

[2]Knockdown MTMR14 promotes cell apoptosis and inhibits migration in liver cancer cells[J].Zhaodong Li,Li Rong,Haifeng Lian,Junning Cheng,Xiaoling Wu,Xiang Li.Gene.2018

[3]A multicentre,open-label,phase-I/randomised phase-II study to evaluate safety,pharmacokinetics,and efficacy of nintedanib vs.sorafenib in European patients with advanced hepatocellular carcinoma[J].British Journal of Cancer.2018(9)

[4]Toward a Tiered Model to Share Clinical Trial Data and Samples in Precision Oncology.[J].Broes Stefanie,Lacombe Denis,Verlinden Michiel,Huys Isabelle.Frontiers in medicine.2018

[5]高婧雅.STYK1/NOK对HepG2及Huh-7细胞凋亡、增殖及细胞周期的影响[D].天津医科大学,2020.