THP-1人单核细胞白血病的应用

背景^[1-3]

THP-1人单核细胞白血病是人外周血的单核细胞系，最初来源于急性单核细胞性白血病患者。属于悬浮细胞，适合用于转染或感染实验。其表面抗原HLA型为：A2，A9，B5，DRw1，DRw2。该细胞对乳汁珠和激活的红细胞有吞噬作用，无表面和胞质免疫球蛋白。可以用佛波醇TPA诱导单核细胞分化。

THP-1（人单核细胞白血病）

细胞培养步骤：

培养基及培养冻存条件准备：

1）准备RPMI-1640培养基；胎牛血清，10%；0.05 mMβ－巯基乙醇；双抗，1%。

2）培养条件：气相：空气，95%；二氧化碳，5%。温度：37摄氏度，培养箱湿度为70%-80%。

3）冻存液：90%血清，10%DMSO，现用现配。

细胞处理：

1）复苏细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入4mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入250px皿中，加入约8ml培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。

2）细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

收集细胞，1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀，将细胞悬液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中。

细胞冻存：

1，细胞冻存时，取上清，可使用血球计数板计数。

2，4min，1000rpm离心去掉上清。加1ml血清重悬细胞，根据细胞数量加入血清和DMSO，轻轻混匀，DMSO终浓度为10%，细胞密度1-2xE6/ml，每支冻存管冻存1ml细胞悬液，注意冻存管做好标识。

3，将冻存管置于程序降温盒中，放入-80度冰箱，至少2个小时以后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。

应用^[4][5]

用于原花青素对LPS诱导的THP-1细胞的影响作用研究

通过LPS诱导THP-1细胞构造脓毒症体外模型，揭示原花青素对脓毒症细胞模型具有显著的保护作用，且在较大的药物浓度范围内无毒副作用。证实原花青素能够抑制TNF-等炎性因子的释放，探讨原花青素抑制TNF-的释放与p38MAPK通路的关系。

方法：将人THP-1细胞进行体外培养（37℃、5％CO2的孵箱内），至对数生长期后，加入LPS1ug/ml制造脓毒症模型。

首先利用细胞药物毒性实验（CCK-8），一是研究原花青素对THP-1细胞增殖活性是否有影响。二是选取药物作用的三个时间点，即6h,12h,24h，在各时间点下依据不同的药物浓度进行分组,研究原花青素对LPS诱导的THP-1细胞生存率的影响，从而选择药物作用较适宜的时间及药物浓度；

其次利用ELISA检测不同药物浓度下TNF-的相对蛋白浓度，选择原花青素的药物作用浓度。最后，利用Western blotting测p38及NF-κB蛋白的表达量，揭示原花青素抑制TNF-的释放与p38MAPK通路的关系。

结果：1、利用CKK-8试剂盒对细胞增殖的活性进行测定，酶联免疫检测仪测450nm处测定吸光度值，用各组细胞活力值（%）表示。与对照组相比，不同的原花青素浓度下变化不明显，对THP-1细胞增殖活力的影响没有统计学意义（P＞0.05）。

2、（1）利用CCK-8试剂盒对各组细胞生存率进行测定，用细胞活力值（%）表示。于6h,12h,24h这三个不同的药物作用时间点下，LPS+不同浓度药物组的细胞活力均低于对照组，有统计学意义（P＜0.05）。

参考文献

[1]TNF-αsignalling and inflammation:interactions between old acquaintances[J].Hana Zelová,Jan Ho?ek.Inflammation Research.2013(7)

[2]Procyanidin dimer B2-mediated IRAK-M induction negatively regulates TLR4 signaling in macrophages[J].Nak-Yun Sung,Mi-So Yang,Du-Sub Song,Jae-Kyung Kim,Jong-Heum Park,Beom-Seok Song,Sang-Hyun Park,Ju-Woon Lee,Jae-Hun Kim,Eui-Hong Byun,Eui-Baek Byun.Biochemical and Biophysical Research Communications.2013

[3]Anthocyanins from black soybean inhibit Helicobacter pylori‐induced inflammation in human gastric epithelial AGS cells[J].Jung‐Min Kim,Kyung‐Mi Kim,En‐Hee Park,Ji‐Hyun Seo,Jae‐Young Song,Sung‐Chul Shin,Hyung‐Lyun Kang,Woo‐Kon Lee,Myung‐Je Cho,Kwang‐Ho Rhee,Hee‐Shang Youn,Seung‐Chul Baik.Microbiol Immunol.2013(5)

[4]Metabolic and toxicological considerations for sepsis drug treatments[J].Sarah C Campbell,Michael G Spigarelli,Joshua Courter,Catherine MT Sherwin.Expert Opinion on Drug Metabolism&Toxicology.2013(1)

[5]李姗.原花青素对LPS诱导的THP-1细胞的影响作用研究[D].大连医科大学,2014.