9-芴甲氧羰酰琥珀酰亚胺的制备及检测

背景及概述^[1][2]

9-芴甲氧羰酰琥珀酰亚胺（简称Fmoc-ONSu）是一种无色或浅黄色针状晶体，分子式C19H15NO5，分子量337.3。9-芴甲氧羰酰琥珀酰亚胺主要用于多肽合成的产品中用于保护氨基酸的加工，其是氨基酸和蛋白质之间的一种有机化合物，通过对多肽的合成过程研究发现其已经成为当前生物化学领域的重要研究方向之一。

制备^[1]

现有的多肽合成普遍采用固相或合成法，其一方面进行合成时原材料消耗好大且合成设备价格昂贵，加工合成效率低、纯度低，合成反应过程较复杂、不易分离；另一方面合成所使用的设备价格昂贵，生产成本投入较高，无法满足中小企业进行加工合成的需求。因此，基于上述问题，CN201310271359.8提供一种用于9-芴甲氧羰酰琥珀酰亚胺制备方法。

本发明目的为克服上述现有技术的不足，提供一种用于9-芴甲氧羰酰琥珀酰亚胺制备方法，一方面能够极大的提高合成生产效率、合成产品纯度，另一方面合成所使用的设备价格适中，能够满足中小企业要求。

技术方案：本发明提供一种用于9-芴甲氧羰酰琥珀酰亚胺制备方法，包括以下步骤，

步骤1、首先将质量比为1:3-4的芴甲氧羰酰氯甲酸酯和琥珀酸亚氨水溶液

作为原料，然后将反应温度控制在40℃-60℃，缓慢搅拌反应10m-30m即得到反应液；

步骤2、在步骤1的反应液中加入无机碱并搅拌反应，其中无机碱为碳酸钠或碳酸氢钠质量比是琥珀酸亚氨水溶液的2-4倍；

步骤3、将步骤3制得的反应溶液进行过滤、洗涤、烘干后即得9-芴甲氧羰酰琥珀酰亚胺，其中烘干温度为30℃-80℃。

优选的所述步骤1中芴甲氧羰酰氯甲酸酯溶液的浓度为7％-10％。

优选的所述步骤1中琥珀酸亚氨水溶液的浓度为6％-9％。

优选的所述步骤1中反应温度为45℃-55℃，反应时间15 m -20 m。

优选的所述步骤2中无机碱为碳酸钠或碳酸氢钠质量比是琥珀酸亚氨水溶液的2.5-3倍。

优选的所述步骤3中烘干温度为50℃-60℃。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

本发明的一种用于9-芴甲氧羰酰琥珀酰亚胺制备方法，解决了现有加工合成效率低、纯度低和方法复杂的的问题，能够快速、简单的加工合成出纯度高的9-芴甲氧羰酰琥珀酰亚胺：同时加工合成所使用的设备价格适中，满足了中小企业加工合成需要，降低了企业生产成本投入。

检测方法^[2]

9-芴甲氧羰酰琥珀酰亚胺是有机合成的重要原料，目前主要用作肽合成和抗血栓类药物中间体。目前对Fmoc-ONSu的合成和应用的研究报道较多，但还没有公开资料介绍Fmoc-ONSu的分析方法。尽管已有文献或专利提到Fmoc-ONSu合成产物的液相色谱含量，但对液相色谱的详细操作条件都没有公开，对于采用哪种类型的高效液相色谱柱及具体操作条件都有待详细摸索。

目前常用的方法是进行柱前或柱后衍生，即试样先和衍生化试剂反应生成稳定的具有紫外生色团或荧光团的衍生化产物，再通过紫外光或荧光检测器获得相应的响应，从而可检测出试样的实际含量。这种方法虽然理论上可以用来测定Fmoc-ONSu的真实含量，但衍生剂稀少，操作手续繁琐，有较大缺陷。

为了克服现有技术的缺陷，提供一种操作方便、测定准确的液相色谱检测方法，本发明公开了一种9-芴甲氧羰酰琥珀酰亚胺纯度的液相色谱测定方法。

本发明通过如下技术方案达到发明目的：

一种9-芴甲氧羰酰琥珀酰亚胺纯度的液相色谱测定方法，采用高效液相色谱仪操作，其特征是：按如下方法依次实施：

a. 设置高效液相色谱仪：高效液相色谱仪的色谱柱作为固定相，固定相为反相键合固定相，即色谱柱的填料选用十八烷基键合相硅胶、辛烷基键合相硅胶和氰基键合相硅胶中的任意一种，填料的粒径不大于5μm，色谱柱的长度为10cm～50cm，色谱柱的内径为4mm～5mm；

高效液相色谱仪的流动相选用水、乙腈、四氢呋喃、环己烷、正己烷、乙醚、二氯甲烷、三氯甲烷和甲苯中的任意一种；

高效液相色谱仪的检测器采用多波长可变紫外-可见光检测器，检测器所发射的紫外线的波长在220nm～370nm；

b. 配制标样溶液：以色谱纯的流动相为溶剂，用容量瓶等仪器将9-芴甲氧羰酰琥珀酰亚胺的标样配制成浓度为0.1mg/mL～1.2mg/mL的溶液作为分析用标样，配制时用超声波脱气溶解并将溶液混合摇匀后作为分析用标样；

c. 配制待测样品溶液：以色谱纯的流动相为溶剂，用容量瓶等仪器将含有9-芴甲氧羰酰琥珀酰亚胺的待测样品配制成浓度为0.1mg/mL～1.2mg/mL的溶液作为待分析的试样，配制时用超声波脱气溶解并将溶液混合摇匀后作为分析用标样；

d. 分析标样：待高效液相色谱仪条件稳定后，用高效液相色谱仪分析标样，用50μL容量的微量注射器向高效液相色谱仪内注入标样，标样各组分得以分离后，得出标样中9-芴甲氧羰酰琥珀酰亚胺组分的峰面积；

e. 分析试样：待高效液相色谱仪条件稳定后，用高效液相色谱仪分析试样，用50μL容量的微量注射器向高效液相色谱仪内注入试样，试样各组分得以分离后，得出试样中9-芴甲氧羰酰琥珀酰亚胺组分的峰面积；

f. 计算纯度：采用外标法以标样定量试样的纯度，待测样品中9-芴甲氧羰酰琥珀酰亚胺的纯度，以质量分数表示，按下式计算：

X1：试样中9-芴甲氧羰酰琥珀酰亚胺的纯度，以百分比表示，

X0：标样中9-芴甲氧羰酰琥珀酰亚胺的纯度，以百分比表示，

A1：试样中9-芴甲氧羰酰琥珀酰亚胺组分的峰面积，

A0：标样中9-芴甲氧羰酰琥珀酰亚胺组分的峰面积，

m1：试样的质量，

m0：标样的质量。

采用外标法分析过程快捷，方便、易操作，分析结果误差小，得到的色谱峰峰形尖锐、对称性好，可作为9-芴甲氧羰酰琥珀酰亚胺合成及提纯过程中的纯度检测，即适用于各种纯度的9-芴甲氧羰酰琥珀酰亚胺样品。

主要参考资料

[1] CN201310271359.8

[2]CN201310683256.2