尿素琼脂培养基基础的应用

背景^[1-3]

尿素琼脂培养基基础用于鉴别肠道菌尿素酶试验，配方（每升）：蛋白胨1g；氯化钠5g；葡萄糖1g；磷酸二氢钾2g；酚红0.012g；琼脂12g；最终pH7.2±0.2。

原理：蛋白胨提供碳源和氮源；氯化钠维持均衡的渗透压；磷酸二氢钾是缓冲剂；具有尿素酶的细菌分解培养基中的尿素，产生大量的氨，使培养呈碱性，酚红指示剂在pH6.8时呈黄色，pH8.1呈粉红色；琼脂是培养基的凝固剂。

尿素琼脂培养基基础

使用方法：

1、称取本品21g，加入蒸馏水或去离子水1 L，搅拌加热煮沸至完全溶解，分装三角瓶，121℃高压灭菌15min，待冷却至50—55℃，每200mL培养基加入经过滤除菌的20%的尿素溶液20mL或5支(029100)40%的尿素溶液共10mL，尿素的最终浓度为2%。分装无菌试管，制成斜面。

2、挑取待检菌的新鲜纯培养物，浓密地涂布在尿素琼脂斜面上，置36±1℃培养24h。

3、于2—4h及24h各观察一次结果。培养基呈现红色时为阳性反应，颜色不变者为阴性反应。如为阴性可继续培养观察至4d。

应用^[4][5]

用于一种耐药变形杆菌的分离、鉴定及其免疫学效应的实验研究

探讨变形杆菌对细胞免疫和体液免疫的影响，为变形杆菌菌苗研究奠定了实验基础。

方法1．留取泌尿系统反复感染患者的尿液样本，将所取样品用分区划线法分别接种于肠道菌选择培养基（S，S琼脂）及鉴别培养基（伊红美蓝琼脂）平皿中，置37℃温箱培养18～24小时后，观察菌落特征，在培养后的平皿中找到符合变形杆菌菌落特点的菌落。将挑出的菌落做进一步的鉴定。

2．用Blendon镀银染色后观察、三糖铁琼脂培养基试验、动力靛基质尿素酶试验、苯丙氨酸脱氨酶试验对挑出的菌落作初步鉴定。

3．从泌尿系统反复感染患者的尿液样本中分离的变形杆菌通过特殊的处理，将原有的毒性减低，并做毒性试验以证明其毒性的降低。再用三糖铁琼脂培养基试验、动力靛基质尿素酶试验、苯丙氨酸脱氨酶试验、迁徙生长试验、硫化氢产生试验、液化明胶试验、西蒙枸橼酸盐试验、吲哚试验、氨基酸脱羧酶试验、糖（醇、苷）类发酵试验（麦芽糖、木糖）、对氯霉素的敏感性试验对特殊处理后的菌种进行最后鉴定。鉴定无误后将经特殊处理的菌种接种、培养、采集、杀菌、离心、纯化，稀释成2×1011／mL的原液，并对原液进行无菌试验和原液检定。

4．将变形杆菌原液用RPMI-1640培养液稀释成2×1010／mL。采集慢性乙型肝炎患者和健康人肝素抗凝外周血，分离外周血单个核细胞，并体外定向诱导分化和培养树突状细胞。对照组为RPMI-1640培养基（含10％小牛血清）500μL+培养的树突细胞；实验组为RPMI-1640培养基（含10％小牛血清）500μL+培养的树突细胞+变形杆菌稀释液，用流式细胞仪检测CD80，CD86的表达水平。

5．将变形杆菌原液用蒸馏水稀释成2×109／mL，腹腔接种BALB／C小鼠。采用3H-TdR摄入法检测小脾细胞经PHA、变形杆菌、ConA体外培养后脾增殖能力的变化；用ELISA法检测鼠血清抗体水平；并通过ELISA检测试剂盒检测脾细胞加入变形杆菌培养后IFN-γ和IL-2浓度。

6．取肝素抗凝外周血制备人外周血淋巴细胞，实验分为五组，分别为只加入培养基、HBcAg、HBcAg+变形杆菌培养液、HBsAg、HBsAg+变形杆菌培养液，用ELISPOT检测五组外周血淋巴细胞分泌细胞因子IFN-γ。

参考文献

[1]Detection of Cellular Immunity to Rabies Antigens in Human Vaccinees[J].Susan M.Moore,Melinda J.Wilkerson,Rolan D.Davis,Carol R.Wyatt,Deborah J.Briggs.Journal of Clinical Immunology.2006(6)

[2]The flavonoid ellagic acid from a medicinal herb inhibits host immune tolerance induced by the hepatitis B virus-e antigen[J].Eun Hwa Kang,Tae Young Kown,Goo Taeg Oh,Weung Feel Park,Sung-Il Park,Sung Kyu Park,Young Ik Lee.Antiviral Research.2006(2)

[3]Different composition of intrahepatic lymphocytes in the immune‐tolerance and immune‐clearance phase of chronic hepatitis B[J].D.Sprengers,R.G.van der Molen,J.G.Kusters,B.Hansen,H.G.M.Niesters,S.W.Schalm,H.L.A.Janssen.J.Med.Virol..2006(5)

[4]Hepatitis B virus‐induced defect of monocyte‐derived dendritic cells leads to impaired T helper type 1 response in vitro:mechanisms for viral immune escape[J].SusanneBeckebaum,Vito R.Cicinnati,XiaZhang,StanislavFerencik,AndreaFrilling,HansGrosse‐Wilde,Christoph ErichBroelsch,GuidoGerken.Immunology.2003(4)

[5]王鹏.一种耐药变形杆菌的分离、鉴定及其免疫学效应的实验研究[D].军医大学,2007.