人角膜上皮细胞说明书

人角膜上皮细胞分离自眼角膜组织；角膜系眼球外膜呈半球形向前突出的部分。占外膜的1/6，横为椭圆形，约11.5～12mm，垂直径约10.5～11mm，厚约1mm，中央部稍Chemicalbook薄约0.8mm；前面曲率半径均值为7.8mm，后面为6.8mm。角膜由致密结缔组织组成，可分为5层，即上皮细胞层、前弹力层、基质层、后弹力层及内皮细胞层。
角膜上皮细胞的体外培养对研究角膜的生理学、病理学、免疫学以及分子生物学都是极为重要的手段，常用于研究细胞代谢产物、病毒感染、各种生长因子和药物对细胞生长的影响。 1.将供体角膜放于消毒过的容器上，上皮面朝上，用手术刀切成12个三角形组织片。应一刀切下，避免锯割。如此仔细处理角膜可减少对胶原基质的破坏和成纤维细胞的脱落。
2.将角膜组织片的上皮面朝向下，放入用鼠尾Ⅰ型胶原蛋白预处理的6孔培养板，每孔放4个组织块。
3.用镊子轻压组织片，以便使组织块与培养皿表面充分接触。将组织片放置20min，使其变干。
4.将一滴KGM轻轻滴于组织片上，在37℃和5%CO2条件下孵育过夜。尽管从眼库得到的供体角膜是用抗菌素的培养液保存的，但全部操作应在无菌条件下进行。
5.第2d，在培养皿中加入1ml培养液。在培养早期，可观察到细胞仅从角膜缘处迁出，但没有细胞从角膜或虹膜迁出。无血清培养液含有低浓度钙离子（0.15mmol/L），减少胶原基质降解，故这种培养液可减少成纤维细胞长出。
6.在植入角膜组织片后第5d，用镊子将组织片取出，再加入3ml培养液。取出组织片后，贴壁细胞继续增值。第2周，细胞生长形成单层，呈现上皮具有的典型卵石状排列特征。每个角膜约获得6×106个上皮细胞。每周换液2次。
7.扩增培养：取出组织片后，当细胞融合达70%-80%时，用PBS浸洗细胞。然后，在37℃条件下用胰蛋白酶-EDTA液处理4min。用含有10%FBS的PBS终止消化。将细胞离心后，用KGM混悬。计数细胞，以1×104个/cm2密度将细胞接种于涂有FNC的培养皿。在37℃、5%CO2条件下培养。1d后换培养液。