常见的 传统载体构建系统

基因克隆是分子生物学中的一种基本的操作方法。即载体构建，构建的实验通俗点来说就是”切、接、转、增、检”，切目的片段和载体，将正确的片段和载体连接，做转化，扩大培养增加构建好的载体数，送测序进行检测；在具体的实验中因为构建的方法不一样会有很多的细节发生变化，现下用的较多的就是双酶切和同源重组的方法。通过双酶切来构建载体是其中常用的一种方法，这种方法利用限制性内切酶可以识别并切割特定的核苷酸的原理，用两种不同的限制性内切酶切割靶基因得到前后都带有粘性末端的靶基因片段，与同样经两种限制性内切酶切割得到的带有相同粘性末端的线性载体在T4 DNA连接酶作用下进行连接，从而实现基因克隆。

一、目的基因的扩增
首先用软件设计目的基因的引物，引物中需要加入酶切位点及保护性碱基，在NCBI上BLAST保证引物的特异性，以及需要注意引物的Tm值、GC含量等等；然后从样本中扩增出我们需要的目的基因的条带，需要用到PCR酶，样本来源可以是基因组DNA也可以是CDNA等，根据构建的载体的不同选择，例如干扰载体、过表达载体、基因编辑载体，启动子分析载体等等；后面将PCR产物跑胶，看产物是否是特异的条带，只需将正确的条带切胶进行胶回收即可，或者取5ul的产物跑胶确认特异性条带后直接将剩下的产物进行胶回收就可以得到目的基因的条带了。

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二、目的基因和质粒载体的酶切和回收
限制酶的选择非常重要，尽量选择粘端酶切和那些酶切效率高的限制酶，所选择的的双切酶是公用的buffer，一致的反应的条件。两种酶切的条件不同时，分别进行两次酶切，切完一个纯化后再切：温度要求不同，先酶切低温要求的，再酶切高温要求的；若盐浓度要求不同，先酶切低盐浓度要求的，再酶切高盐浓度要求的。包括酶的用量，以及产物或者质粒与酶之间的量的把握也是至关重要的，即避免酶切不完全的情况，也在规定的时间内达到的酶切效果。回收可以采用凝胶电泳跑电泳切胶来进行，也可以采用简单的柱式产物回收的方法，由于切割后不需要的片段很短，所以在柱式纯化中可以过滤掉，避免了切胶回收的复杂的操作。

三、限制性核酸内切酶
限制性核酸内切酶首先是在细菌体内发现的，几乎所有的细菌的属、种都发现了这种酶。它是可以识别并附着特定的核苷酸序列，并对每条链中特定部位的两个脱氧核糖核苷酸之间的磷酸二酯键进行切割的一类酶，简称限制酶。每个限制性内切酶会识别特定的DNA序列，根据不同的限制酶类型，可在识别序列内或距识别序列不远处的位置切割DNA，识别序列通常是4-8bp，酶切之后会形成粘性末端（5ˊ端或3ˊ端突出）或者平末端。（图1）

根据限制酶的结构，辅因子的需求切位与作用方式，可将限制酶分为三种类型，分别是型（Type I）、第二型（Type II）及第三型（Type III）。Ⅰ型限制性内切酶既能催化宿主DNA的甲基化，又催化非甲基化的DNA的水解；而Ⅱ型限制性内切酶只催化非甲基化的DNA的水解。Ⅲ型限制性内切酶同时具有修饰及认知切割的作用。其中Type II型限制性内切酶只具有识别切割的作用，修饰作用由其他酶进行。所识别的位置多为短的回文序列（palindrome sequence），所剪切的碱基序列通常即为所识别的序列；是遗传工程上，实用性较高的限制酶种类，例如：EcoRI、HindⅢ、BamH I、ApaLI、。有些酶的切割位点在回文的一侧（如EcoR I、BamH I、Hind等），因而可形成粘性末端，另一些Ⅱ类酶如Alu I、BsuR I、Bal I、Hal Ⅲ、HPa I、Sma I等，切割位点在回文序列中间，形成平整末端。

图1：特定的限制酶切割后产生的粘性末端和平末端

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四、酶切、回收后的PCR产物与载体质粒的连接
用T4 DNA Ligase进行连接反应，不同厂家的连接酶按照说明书操作即可，如果担心质粒存在酶切不完全的情况在后续的转化中出现假阳性结果，可以将酶切后的产物不连接作为对照试验。连接酶容易失活，注意低温操作，在冰上，时间3个小时足已。

五、构建好的质粒做转化
将构建好的载体加入至感受态细胞中，冰中放置30分钟，42℃加热45秒钟后，再在冰中放置1分钟，
加入阴性培养基，37℃振荡培养60分钟，取其中一些铺板，过夜培养挑取单克隆进行摇菌，提取质粒即可。

六、其他克隆的试剂盒